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研究背景小耳畸形是整形外科常见的疾病,影响着患者的器官功能,容貌及心理健康。自体软骨移植是目前临床应用最为广泛的修复耳软骨缺损的方法,但存在着并发症较多,移植物供体缺乏的问题。软骨组织工程为其治疗带来新的途径。软骨组织工程的主要方法是从生物体内获得少量具有成软骨能力的种子细胞,经体外培养扩增后接种于生物材料,构建出可用于人体的软骨移植物。体外构建的软骨可应用于先天性小耳畸形及疾病、外伤等造成的软骨缺损的手术修复中,也可应用于整形美容领域。但目前如何获得大量有成软骨能力的种子细胞是限制其临床效果的主要问题之一。选定可用作种子细胞的具有高软骨形成潜能的干细胞来源对于实现弹性软骨的再生治疗至关重要。课题组前期对人耳软骨细胞进行单细胞测序,发现了一些可能作为耳软骨来源干细胞的细胞表面标志物的基因。进一步筛选其中可以作为特异性的软骨干/祖细胞表面标志物的特异性基因,可以为获得更理想的耳软骨组织构建种子细胞提供参考。研究目的1.明确兔及人耳软骨组织中CD93,CD271,CD202b,CD184,CD243的表达及组织定位。2.明确CD93,CD271,CD202b,CD184,CD243在体外培养的不同代次残耳软骨细胞中的表达情况。3.在体外分选出CD271+的细胞亚群,并对其细胞学特性进行鉴定,从而为后续软骨组织工程种子细胞的选取提供新的思路。研究方法和结果1.兔耳软骨及人残耳软骨中CD93,CD271,CD202b,CD184,CD243的表达及组织定位方法:通过HE染色分析兔及人耳组织横断面结构,使用免疫组织化学染色的方法观察CD93,CD271,CD202b,CD184,CD243蛋白在兔及人耳软骨中的表达情况,并进行组织定位。结果:兔耳软骨组织切片HE染色结果展示了完整的兔耳软骨横断面,软骨层可见浅蓝色软骨基质,卵圆形边界清晰的软骨陷窝,以及深蓝色的软骨细胞核,腹侧耳软骨膜为疏松纤维层状结构,背侧耳软骨膜较腹侧致密,纤维层更少;兔耳软骨组织切片免疫组化染色结果显示CD93在软骨组织、软骨膜及外周组织层均未见阳性染色;CD243和CD202B在软骨细胞中表达为弱阳性;CD184染色显示其显著表达于软骨细胞的细胞膜上,在背、腹侧软骨膜及外周组织中均未见表达;CD271的染色结果显示耳软骨细胞、软骨膜细胞及外周肌肉组织层均有显著阳性表达。人残耳软骨组织切片的HE染色结果显示与兔耳软骨相比,人耳软骨细胞较小,软骨膜与软骨组织的结合更加紧密,有纤维突起深入到软骨组织中。人残耳软骨的免疫组化染色结果显示,在软骨细胞中,只有CD93蛋白表达为阴性,CD184、CD243均有阳性表达,CD202b及CD271表达为强阳性。同时,CD184、CD243、CD202b、CD271在血管内皮中的染色为阳性。2.CD93,CD271,CD202b,CD184,CD243标志物在体外培养的不同代次残耳软骨细胞中的表达方法:应用流式细胞术鉴定不同代次体外培养人残耳软骨细胞的CD93,CD271,CD202b,CD184,CD243标志物的阳性率。然后分选出CD271+及阴性的耳软骨细胞。结果:CD93、CD184、CD243、CD202b在体外培养的P2及P3代的耳软骨细胞中表达率较低;CD271在P1代软骨细胞中表达率较高,随体外培养传代,其阳性率逐渐减少。3.人残耳软骨来源的以CD271为标志物的不同细胞亚群的功能鉴定方法:使用流式细胞术分选出CD271+及阴性的耳软骨细胞进行体外培养及形态观察;用CCK-8试剂盒检测CD271+及CD271-两组细胞亚群的增殖能力;使用细胞划痕实验检测两组细胞群的迁移能力;使用无限稀释法构建两组细胞的单克隆,鉴定CD271+及CD271-细胞亚群的单克隆形成能力;用成脂诱导分化的培养基对CD271+及CD271-两组细胞群进行诱导分化后使用油红O染色鉴定其成脂能力;用成骨诱导分化的培养基对CD271+及CD271-两组细胞群进行成骨诱导分化后使用茜素红染色鉴定其成骨能力;用成软骨诱导分化培养基对CD271+及CD271-两组细胞群进行成软骨诱导分化后,阿利辛蓝染色鉴定其成软骨能力。结果:P1代CD271+的耳软骨细胞细胞亚群呈短梭形,增殖速度较快;用CCK-8法对比CD271+及CD271-两组细胞群的增殖能力,发现CD271+的细胞群增殖速率显著高于CD271-的细胞。CD271+的细胞具备单克隆形成能力,而CD271-的不能形成单克隆。与CD271-细胞亚群相比,CD271+的细胞具有较强的向三系分化的能力。研究结论1.在兔及人残耳软骨组织中,CD93几乎不表达,CD271有较高的阳性表达率。而CD184、CD243、CD202b在兔及人残耳软骨组织中表达的阳性率不一致。2.在体外培养的P2及P3人残耳软骨细胞中,CD93、CD184、CD243、CD202b的阳性表达率较低,CD271在P1代软骨细胞中阳性率较高,随着细胞传代,其阳性率逐渐降低。3.CD271+的耳软骨细胞在体外具备单克隆形成能力,其增殖、迁移、分化能力均优于CD271-的细胞,提示残耳软骨组织来源的CD271+细胞可能具备干/祖细胞特性。