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【研究目的】 脆性X综合征（Fragile X syndrome,FXS）是一种常见的遗传性智力低下疾病，其临床症状主要包括癫痫、多动症、对刺激敏感性增加等神经元兴奋性增加症状。脆性x综合征是由于脆性X智力低下蛋白（FMRP）缺失而引起的，FMRP作为一种RNA结合蛋白，可与多种RNA结合，可作为翻译抑制因子负性调控多种RNA的翻译。代谢型谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptors,mGluR）与FXS的病理生理机制密切相关，FMRP是1组代谢型谷氨酸受体信号通路的重要抑制蛋白，其缺失将导致该通路异常亢进，影响其下游一系列蛋白的表达水平，其中可能包括一部分影响神经元兴奋性的蛋白，如离子通道蛋白。FXS中神经元兴奋性增加可能和亢进的mGluR信号通路密切相关。钾电流是动作电位复极化时程最重要的电流，钾电流水平下降可导致动作电位发放增多，时程延长等变化，导致神经元兴奋性增高。因此我们猜测钾电流很可能是Group1 mGluR的下游调控对象，该通路通过调控钾钾电流的水平影响神经元兴奋性。本研究主要选取10天龄野生型（WT）和Fmr1基因敲除（KO）小鼠，研究了Group1 mGluR对神经元动作电位发放及突触传递的影响，并探索钾电流对突触传递效能的影响，最后比较两组小鼠全细胞钾电流水平差异，并且研究了Group1 mGluR对钾电流特性的影响，总结探讨钾电流在Group1 mGluR调控KO小鼠神经元兴奋性中的作用。 【实验方法】 1.制备KO和WT小鼠急性分离海马脑片。 2.在全细胞记录模式下记录KO和WT小鼠海马CA1区神经元动作电位和EPSC发放特性，比较两者差异，并使用Group1 mGluR激动剂和拮抗剂研究Group1 mGluR对两组神经元输入和输出特性的影响。 3.在电压钳模式下，研究Group1 mGluR拮抗剂MPEP对WT和KO小鼠神经元全细胞钾电流的影响，通过分析钾电流峰电导、激活、失活、复活等特性评价Group1 mGluR信号通路对钾通道的调控作用。 【研究结果】 1.使用电流钳技术对WT和KO小鼠神经元动作电位的发放研究发现，Group1 mGluR激动剂(S)-3,5-dihydroxyphenylglycine（DHPG）可显著增加WT组神经元动作电位发放频率（P＜0.05,paired t test.n=8），而对KO组作用无统计学意义。相反，Group1 mGluR拮抗剂2-methyl-6-(phenylethynyl)pyridine（MPEP）可以显著抑制KO组神经元动作电位频率（P＜0.01,paired t test.n=9），但对WT组作用无显著作用。对神经元爆发样放电事件分析中发现，DHPG显著增加WT组爆发样放电事件频率（P＜0.05,paired t test.n=8），但对KO组作用不显著，而MPEP则显著减少KO和WT两组爆发样放电频率（P＜0.01,paired t test.n=8,for WT;n=9,for KO），且MPEP导致的爆发样放电频率降低的百分比在两组神经元有显著的差异（P＜0.01,ttest.n=8,for WT;n=9,for KO）。进一步研究诱发性动作电位中发现，不论在出生后组还是30天龄组，KO小鼠爆发样放电神经元比例更高（p=0.0040,for P10;p=0.036 for P30,Chi-square test），且MPEP可以降低两组神经元诱发的动作电位的频率（p=0.0090,for group P10;p=0.0308,for P30,one-way ANOVA and post-hoc LSDtest.n=7,for WT for P10;n=8 for KO for P10 and KO for P30;n=9 for WT P30），甚至导致爆发样放电模式转变常规放电模式，此现象在10天龄KO组上更为显著（p=0.0419,Chi-square test）。提示mGluR受体通路的亢进与脆性小鼠的神经异常放电有关，MPEP的拮抗作用可显著改变动作电位的发放频率和模式。 2.使用电压钳技术对WT和KO小鼠神经元sEPSC发放的研究显示，KO组神经元sEPSC的数量、平均频率、平均波幅均显著高于WT组（平均波幅P＜0.05;平均频率、数量P＜0.01,t test.n=6,for WT;n=5,for KO）。MPEP可减少WT组sEPSC的数量和平均频率（数量,P＜0.01;平均频率,P＜0.05,paired t test.n=6,for WT;n=5,for KO）；MPEP还可显著降低KO组sEPSC数量和平均波幅（P＜0.05, paired t test.n=6,for WT;n=5,for KO），其中对平均波幅的降低百分比与WT组相比较具有显著差异（P＜0.05,t test.n=6,for WT;n=5,forKO）。结果提示KO神经元亢进的mGluR通路是其兴奋性突触传递增高的重要原因之一。 3.在海马Schaffer collateral投射通路中给予诱发刺激，记录WT和KO小鼠CA1神经元的诱发性EPSC(eEPSC)。结果显示KO组神经元eEPSC波幅和延迟时间水平均比WT组显著增高（P＜0.05,t test.n=4,for WT;n=5,for KO）。钾通道阻断剂4-AP可显著提高WT组神经元eEPSC波幅和延长时间（波幅,P＜0.05;延长时间,P＜0.01,paired t test.n=4,for WT;n=5,for KO），而对KO组影响不显著。此外，4-AP可显著提高WT组神经元双脉冲刺激比率（PPR）（P＜0.01,paired t test.n=4, for WT;n=5,for KO），但对KO组影响不显著。结果提示KO和WT神经元的突触传递强度存在显著差异，而在WT神经元中利用4-AP减少钾电流可产生与KO神经元的突触传递和突触传递易化特性的相对应的改变，推测钾电流参与了KO神经元的突触传递特性改变。 4.利用电压钳技术对WT和KO小鼠研究全细胞钾电流证实了KO组钾电流峰值和稳态钾电流均比 WT组下降（P＜0.01,one-way ANOVA and post-hoc LSD test.n=5,for WT;n=6,for KO）。MPEP可显著提高KO组神经元最大钾电流电导（P＜0.05,one-way ANOVA and post-hoc LSD test.n=5, for WT;n=5, for KO），并有效降低钾电流复活时间常数（P＜0.05, one-way ANOVA and post-hoc LSD test.n=5,for WT;n=5,for KO），而对WT组效果不显著；MPEP不影响激活和失活动力学参数。结果提示mGluR的拮抗可部分挽救KO神经元钾电流的降低，推测钾电流的调节是MPEP治疗脆性X综合征的重要机制。 【结论】 1.Fmr1敲除鼠海马CA1区神经元兴奋性增高与代谢型谷氨酸信号通路功能亢进密切相关。 2.拮抗Fmr1敲除鼠亢进的mGluR信号通路可有效降低Fmr1敲除鼠海马CA1区神经元突触传递效能。Fmr1敲除鼠突触传递效能增加可能是其动作电位发放功能亢进的重要原因。 3.Fmr1敲除鼠存在钾通道功能的部分缺失，钾电流的降低与Group1 mGluR信号通路异常亢进引起的神经元兴奋性增加密切相关。钾电流的调节可能是MPEP治疗脆性X综合征的重要机制。