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卵母细胞胞质内单精子注射是一种重要的体外受精技术己运用到了很多的动物上并获得了成功,在猪这个物种上同样获得了ICSI后代。随着胚胎技术研究的深入发展和转基因技术的不断应用,猪ICSI的研究得到了更多研究者们的重视。虽然目前在猪上已经有ICSI后活的仔猪出生,但是目前猪上ICSI研究仍然面临着诸多问题,主要是胚胎受精率和胚胎发育率低,对限制猪ICSI技术的因素的机理研究较少等。本实验主要是利用Piezo显微操作系统探讨了操作液中添加不同物质、精子不同预处理方法、不同的辅助激活方式对猪ICSI胚胎体外发育的影响。以求获得最佳的ICSI实验技术路线。进一步对比冻精ICSI胚胎与IVF胚胎体外发育衡量本实验ICSI方案的优劣。实验一:活精子分别以液氮反复次冻融3次处理、添加0.1%Triton X-100后冻融-处理和在室温的条件下50k HZ超声波震荡10s处理后进行胞质内注射。实验二:活精子以液氮反复冻融3次处理后,在100ul TL-HEPES操作液中添加Cytochalasin B(7.5ug/ml CB)、或者浓度为5%10ul PBS-PVA显微操作滴进行胞质内注射,以100ul TL-HEPES操作液为对照组。实验三:主要对比不同激活方式对ICSI胚胎发育率的影响,即用反复冻融的精子进行ICSI后,用电激活(采用2次直流电脉冲,1.2 kv/cm,30μs)、6-DMAP激活和钙离子激活剂A23187激活等三种激活方法对卵母细胞进行辅助激活,对照组在精子注射后不做任何处理。实验四:经过以上实验组的结果分析,采用最有效的实验方法用反复冻融的精子在操作液中添加(CB和PVA?哪个实验更好,实验添加哪个?)并以电激活的辅助激活方式进行胞质内注射获得的ICSI胚胎与IVF胚胎体外发育情况的比较,以及ICSI与IVF受精卵体外培养12-15h后原核形成情况。结果如下:实验一:与对照组相比三种不同的预处理组均能显著提高注射卵的卵裂率和囊胚率(82.57%、87.60%、65.69%vs 57.59%;33.33%、33.67%、35.48%vs 20.07%)(P<0.05)。实验二:与对照组相比操作液中添加(CB或者PVA)方法能显著提高注射卵的活胚率(86.55%vs 78.45%;85.96%vs 80.17%)。卵裂率(87.38%vs 93.41%;84.96%vs 89.25%)和囊胚率(30.39%vs 23.58%;32.76%vs 25.47%)无显著影响。实验三:与对照组相比三种不同的辅助激活方法的体外发育比较中,电激活实验组能显著提高注射卵的卵裂率和囊胚率(77.78%vs 64.21%;24.37%vs 8.66%)(P<0.05)。Calcium ionophore A23187激活实验组囊胚率与对照组比较有显著差异,但是没有电激活组提高的效率高(16.52%vs 8.66%)(P<0.05)。实验四:ICSI胚胎与IVF胚胎体外发育情况相比卵裂率和囊胚率有限显著差异(80.65%vs 69.83%;27.55%vs 17.17%)(P<0.05)。ICSI与IVF受精卵体外培养12-15h后原核形成情况比较正常受精率也有差异(42.59%vs 23.33%)。以上结果表明,不同精子处理方法都可以显著提高ICSI胚胎囊胚率,操作液中添加CB或者PVA对于ICSI胚胎后期卵裂率和囊胚率无显著影响;单精子注射后,电激活方法可以显著提高猪ICSI胚胎卵裂率和囊胚率。针对以上研究结果,筛选出最优实验方案后,研究者进一步比较了优化后的ICSI体系获得的猪体外胚胎与传统IVF获得的体外胚胎的效率与质量,结果表明,与IVF组相比,ICSI没有影响猪卵裂率、囊胚细胞数,但是显著提高了猪囊胚率。此外核型分析表明,ICSI显著提高了猪正常核型受精卵的比例。这些结果说明,经过优化的ICSI体系,可以高效生产猪体外胚胎。