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目的：结直肠癌(CRC)在我国的发病率和致死率呈不断上升趋势。包括免疫治疗在内的综合治疗在结直肠癌治疗中起到越来越重要的作用。通过多种方式用肿瘤抗原刺激自体淋巴细胞获得抗原特异性杀伤细胞的研究众多,肿瘤细胞表面的抗原被抗原提呈细胞(APC)加工成抗原肽与主要组织相容复合物(MHC)分子形成复合物提呈给T细胞并诱导其活化,形成肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。转化生长因子βII型受体(TGFβRⅡ)和O位N-乙酰葡萄糖胺糖基转移酶(OGT)基因的框移突变产生的两种新生抗原具有HLA-A2限制性,存在于20-40%的HLA-A2限制性结直肠癌患者且不存在于正常人和其他肿瘤患者,提呈后的抗原肽分别为TGFβRⅡ (RLSSCVPVA,131-139)和OGT (SLYKFSPFPL,28-37).肿瘤为了逃避识别,下调甚至不表达MHC分子,部分肿瘤患者免疫细胞数下降功能低下都会造成肿瘤抗原无法提呈,导致T细胞无法活化。针对上述T细胞无法活化的现状,我们人工合成抗原肽并与患者的外周血T细胞共培养,以提高结肠癌特异性T细胞的活化效率。接下来,用树突状细胞(DC)结合抗原肽诱导活化杀伤性T细胞与抗原肽直接刺激活化细胞比较杀伤效能,以期获得同等或者更好的杀伤效果且减少体外对细胞操作,降低副反应发生率。综上所述,本课题旨在构建简便有效的肿瘤特异性T细胞的制备方法,以达到增强特异性同时降低更加安全的目的。方法：合成TGFβRⅡ (RLSSCVPVA,131-139)和OGT (SLYKFSPFPL,28-37)两段抗原肽,质谱分析进行纯度鉴定；筛选获得表达TGFβRⅡ (RLSSCVPVA,131-139)和OGT(SLYKFSPFPL,28-37)且具有HLA-A2限制性的结肠癌细胞系一株：DLD-1。选择具有HLA-A2限制性的结直肠癌患者,应用密度梯度离心法和细胞因子刺激方式分离外周血培养获得结直肠癌患者CD8+T细胞为主的外周血单个核细胞(PBMC)昆悬液,流式细胞分析鉴定刺激培养前后细胞表型及比例；使用抗原肽与CD8+T细胞共培养刺激活化产生抗原特异性CTL, MTS实验测定针对DLD-1结肠癌细胞系不同效靶比的杀伤效应,ELISA方法评估了各组IFN-□分泌情况以进一步评估CTL活化和杀伤能力。其次,表达HLA-A2分子健康人的PBMC诱导获到成熟DC附载抗原肽刺激相应个体T细胞活化形成抗原特异性CTL,比较DC疫苗诱导的CTL与直接使用抗原肽刺激的CTL杀伤活性。结果：我们获得的TGFβRⅡ (RLSSCVPVA,131-139)和OGT (SLYKFSPFPL,28-37)抗原肽,纯度≥99%,分别加入到表达HLAA2分子的结直肠癌患者和健康人PBMC,DC进而诱导形成的抗原肽特异性CTL,经MTS试验证实经抗原肽刺激2的结直肠癌患者T细胞混悬液在第杀伤实验3天效靶比为5/1,10/1,20/1分别获得对DLD-1的48.54%,63.62%和70.23%杀伤率,低于健康对照组的杀伤率为66.32%,74.82%和81.61%,仅在10/1条件下无抗原肽处理患者组的杀伤能力优于健康对照,说明抗原肽刺激无法提高结肠癌患者自体免疫细胞杀伤DLD-1的能力。另外,与DC细胞负载抗原肽诱导形成的肿瘤抗原肽特异性CTL相比,直接使用抗原肽刺激正常人的T细胞为主的PBMC诱导得到的特异性CTL能够对DLD-1获得更好的杀伤效果：与DC负载抗原肽诱导形成的肿瘤抗原肽特异性CTL相比,直接刺激获得的特异性CTL第14天在效靶比为5/1时,DC负载抗原肽1(OGT)与抗原肽1直接刺激获得的CTL对DLD-1的杀伤率分别为26.71%和65.84%(P=0.054),DC负载与抗原肽2(TGFβRⅡ)直接刺激的CTL对DLD-1的杀伤率分别为20.69%和81.32%(P=0.039),DC负载与抗原肽1+2直接刺激的CTL对DLD-1的杀伤率分别为39.91%和69.24%(P=0.048)。在效靶比为10/1时,DC负载与抗原肽1直接刺激的CTL对DLD-1的杀伤率分别为36.33%和88.82%(P=0.038),DC负载与抗原肽2直接刺激的CTL对DLD-1的杀伤率分别为37.51%和89.74%(P=0.022),DC负载与抗原肽1+2直接刺激的CTL对DLD-1的杀伤率分别为45.58%和86.61%(P=0.043)。结论：本研究合成的两种结直肠癌新生抗原肽直接负载在健康人细胞中能获得对DLD-1较高的杀伤效果。两种抗原肽可能成为未来作为结肠癌免疫治疗的新靶点。