【摘 要】
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启动子是合成生物学中最重要的元件之一,可以决定转录的起始位置并控制转录起始时间和表达强度。启动子改造工程是代谢工程和合成生物学中控制基因表达的常用方法。解脂耶氏酵母是一种非常具有代表性的非常规酵母,可以在多种环境下生长,如低p H和高渗透压等,因此具有良好的工业应用价值。本研究利用代谢工程技术对解脂耶氏酵母的内源启动子进行改造,构建了稳定表达的启动子文库。随后,以异戊醇作为平台化合物,利用所构建的
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启动子是合成生物学中最重要的元件之一,可以决定转录的起始位置并控制转录起始时间和表达强度。启动子改造工程是代谢工程和合成生物学中控制基因表达的常用方法。解脂耶氏酵母是一种非常具有代表性的非常规酵母,可以在多种环境下生长,如低p H和高渗透压等,因此具有良好的工业应用价值。本研究利用代谢工程技术对解脂耶氏酵母的内源启动子进行改造,构建了稳定表达的启动子文库。随后,以异戊醇作为平台化合物,利用所构建的启动子文库对异戊醇的合成途径进行优化。主要研究内容如下:（1）筛选合适的报告基因。首先将不同的绿色荧光蛋白基因GFPuv、hr GFP和hr GFPO（经过密码子优化的hr GFP）以组成型启动子PUAS1B4-LEUm(Php4d)驱动表达,利用荧光显微镜和流式细胞仪检测荧光的表达强度。荧光表达强度较高且表达稳定的绿色荧光蛋白基因用于表征所构建启动子的强度。（2）内源启动子(PTEF、PLEU和PEXP)的表征。对解脂耶氏酵母中的三个内源启动子(PTEF、PLEU和PEXP)进行表征,探究了这三种内源启动子的活性,为构建启动子文库奠定基础。（3）人工启动子文库的构建。通过将不同的启动子元件（UAS、TATA box和核心启动子）进行人工重排,构建了含有21个稳定表达的人工合成启动子文库。（4）为了验证所构建的启动子文库的功能特性,以异戊醇为平台化合物进行生产验证。首先,将来自酿酒酵母中功能确定的转氨酶基因Sc BAT1、脱羧酶基因Sc ARO10和醇脱氢酶基因Sc ADH2,以及这些基因在解脂耶氏酵母中的同源基因Yl BAT1-1、Yl BAT1-2、Yl ARO10-1、Yl ARO10-2、Yl ADH2-1、Yl ADH2-2、Yl ADH2-3、Yl ADH2-4和Yl ADH2-5分别进行单基因过表达。随后对效果较好的Sc BAT1、Sc ARO10和Sc ADH2进行组合过表达构建重组菌株Po1g BAA。经过发酵以后,重组菌株Po1g BAA中异戊醇的产量达到1.8 mg/L,比原始菌株Po1gΔKU70提高了3.9倍。（5）利用启动子文库优化异戊醇生物合成途径。从启动子文库中选择了9个不同强度的启动子驱动表达异戊醇途径的关键基因Sc ARO10。经过发酵以后,异戊醇的最高产量达到11.57 mg/L,比原始菌株Po1gΔKU70提高了30.3倍。本研究利用代谢工程和分子生物学技术对解脂耶氏酵母的启动子进行改造,构建了可以稳定表达的启动子文库,首次证明了上游激活序列UAS元件可以在酵母间进行功能转移,这一发现对于进一步阐明酵母启动子的作用机制具有重要意义。另外,本研究通过启动子工程和代谢工程技术的结合使用来尝试提高异戊醇的产量,成功提高了异戊醇在解脂耶氏酵母中的产量。本研究为非常规酵母的启动子工程提供了理论依据,为未来优化其它高值化学品的微生物合成提供了有价值的思路。
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