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目的元胡止痛片是临床常用的镇痛效果确切的中成药,其组方简单、疗效确切,收载于1985年以后各版中国药典。其制法常采用传统醇回流提取法,导致药物服用量大、起效慢等不足,限制了该药物的临床应用,因此进行其制备新工艺的研究是必要的。本课题在先期研究基础上,使用二氧化碳超临界萃取法(CO2-SFE)对元胡白芷药材进行提取,采用高效液相色谱法(HPLC)对CO2-SFE和传统醇回流提取法所得萃取物进行比较,客观评价两种提取方法的优劣。中药药效物质基础及作用机制的研究是中药现代化的重要内容,虽元胡、白芷单药成分的镇痛机制已有部分研究,但两者配伍应用对体内致痛和镇痛物质的影响并未见相关报道。本研究拟观察元胡白芷配方药液对不同大鼠疼痛模型的镇痛作用,并从体内因子含量水平,探讨其相关的镇痛机制；并进一步比较CO2-SFE与传统醇回流法引起的药效作用差异。方法1.药物的提取及含量测定：(1)CO2-SFE提取元胡白芷药材：采用已优化的CO2-SFE提取工艺,设定相应参数,对元胡白芷药材分别进行提取；(2)醇回流法提取元胡白芷：采用药典及文献中报道的方法,对元胡白芷药材进行提取；(3)HPLC含量测定：以延胡索乙素(THP)为质控指标,测定元胡萃取液的提取率；以欧前胡素及异欧前胡素为指标,测定白芷萃取液的提取率。2.元胡白芷对p-内啡肽及单胺类神经递质的影响研究：(1)建立大鼠福尔马林疼痛模型；(2)记录观察大鼠行为学指标变化,评价药物的镇痛效果；(3)采用放射性免疫标记法测定大鼠血浆及脑组织中p-内啡肽含量；(4)采用HPLC-荧光检测法测定大鼠血中及脑组织中单胺类神经递质(5-HT,DA,NE)含量。3.元胡白芷对前列腺素类物质的影响研究：(1)建立大鼠痛经模型；(2)记录观察大鼠扭体反应的发生率及发生次数,评价药物的镇痛效果；(3)采用酶联免疫法测定大鼠血浆中前列腺素E2及F2α的含量,并计算两者的比值。4.药效作用的比较研究：使用2和3中提到的动物模型及实验步骤,动物分组设置CO2-SFE、醇回流提取组,比较两种提取方法在镇痛作用方面的差异。5.统计学分析：采用统计学软件SPSS13.0进行数据分析,计量资料应用x±s表示,两组间比较采用非配对t-检验,多组间比较用单因素方差分析。P<0.05被认为有统计学差异。结果1.CO2-SFE提取物含量优于醇回流法：经CO2-SFE提取元胡生药材,以THP计,含量为0.800mg/g生药材,醇回流法提取的含量为0.255mg/g生药材；白芷经CO2-SFE提取,以IMP计,含量为0.635mg/g药材,iso-IMP含量为0.340mg/g药材,醇回流法所得萃取液的含量分别为0.309mg/g药材及0.286mg/g药材。CO2-SFE所得药物有效成分含量明显高于醇回流法。2.元胡白芷配方能够降低β-EP及外周血中5-HT、DA及NE的含量：(1)成功复制大鼠福尔马林疼痛模型,大鼠表现典型的双时相痛反应行为；(2)元胡白芷配方对福尔马林疼痛模型有很好的镇痛效果,且以对第Ⅱ时相作用为主；(3)与模型组相比,元胡白芷配方能够降低脑组织中p-EP含量(P<0.05),降低血浆中p-EP含量(P<0.05),与吗啡组相比无统计学差异；但不存在剂量依赖关系；(4)与模型组相比,元胡白芷配方能够显著降低外周血中5-HT、DA及NE的含量(P<0.05),对中枢内单胺类神经递质的影响不明显。3.元胡白芷配方可降低痛经模型血中PGF2α的含量,降低PGF2α/PGE2,具有剂量依赖关系：(1)成功复制大鼠痛经模型,以扭体反应的发生率及发生次数进行评价；(2)元胡白芷配方对大鼠痛经效果良好,可显著降低扭体反应的发生率,且存在剂量依赖性；(3)与模型组相比,元胡白芷配方可降低痛经模型大鼠外周血中PGF2α的含量(P<0.05),升高PGE2的含量,能够剂量依赖性地降低PGF2α/PGE2(P<0.05),高剂量组与阿司匹林组相比无统计学差异(P>0.05)。4. CO2-SFE提取物药效优于醇回流法：(1)大鼠福尔马林疼痛模型：同等剂量元胡白芷提取液,CO2-SFE组镇痛效果优于醇回流组,痛反应持续时间短；与模型组相比,血浆、脑组织β-EP的含量,CO2-SFE组分别降低36%,16%；而醇提取β-EP的含量降低约25%,12%(P<0.05)；(2)大鼠痛经模型：同等剂量元胡白芷提取液,CO2-SFE组扭体反应的发生率及发生时间均低于醇回流组；与模型组相比,给药组可降低PGF2α的含量(P<0.01)：CO2-SFE组降低23.7%,醇提取组降低约16.2%。结论1.建立了HPLC测定THP、IMP及iso-IMP的方法；经HPLC测定,与醇回流法相比,CO2-SFE所得元胡白芷药材提取液,有效成分的萃取率显著高于传统醇回流法,且操作简单。2.元胡白芷配方对福尔马林疼痛模型第Ⅱ时相镇痛效果好；能显著降低脑组织和血浆中β-EP含量,推测其镇痛作用的发挥与内源性阿片肽系统有重要的关系；对中枢内单胺类神经递质的含量没有明显影响。3.通过雌激素联合缩宫素可成功建立大鼠痛经模型,具有与人类原发性痛经机理类似、建模时间短、适于药物干预的特征；元胡白芷配方药液对痛经模型大鼠有显著镇痛效果,能够剂量依赖性降低PGF2α的含量,降低PGF2α/PGE2,推测镇痛作用的发挥与降低前列腺素的含量密切相关。4.两种方法(CO2-SFE与醇回流)所得提取液用于两个疼痛模型均可产生镇痛效果,但前者的镇痛效果显著优于后者,且对内源性因子的影响也存在明显优势。