乳链菌肽(Nisin)作为高效、安全的天然食品防腐剂得到广泛应用。成熟的nisin含有34个氨基酸，由5个硫醚桥组成独特的内环结构，是研究蛋白质结构与功能的一个很好的材料。同时，其特殊的诱导调控机制也引起了人们极大的兴趣。近年来人们试图通过基因工程的方法改变nisin的一些特性，从而扩展这一生物活性物质的应用。本论文对Nisin生物合成基因簇进行克隆，系统研究了nisZ启动子和结构基因的结构与功能关系。 1、以乳链菌肽高产菌株L．lactis AL2为供体构建了乳酸乳球菌的基因文库，从基因文库中筛选到了完整的乳链菌肽生物合成基因簇。在乳酸乳球菌中克隆并表达了乳链菌肽的前体基因，并对转化子L．lactis NZ9800／pHJ201的菌株特性进行了研究。通过DNA序列测序证实了用于产业化生产的乳链菌肽高产菌株L．lactis AL2分泌的乳链菌肽为nisinZ，该菌株的乳链菌肽前体基因及其上游启动子与普通乳链菌肽产生菌无差异。 2、结合以前研究的正结果，通过定点突变的方法获得了2个组合双突变，经过阳离子交换树脂Sephedax CM-25和凝胶Sephedax G-25层析纯化突变体，对突变体的生理生化特性进行了研究，这两个突变体的抑菌活性比野生型乳链菌肽略低，抑菌谱及溶解性与乳链菌肽相同，N27K／H31K和乳链菌肽的稳定性相似。值得注意的是，T2S／H31K在中性或碱性pH以及高温条件下，比野生型乳链菌肽有更好的稳定性，是稳定性提高的Nisin变体。 3、乳链菌肽B环中氨基酸的改变对乳链菌肽分子结构与功能的影响到目前为止尚未见文献报道。我们将B环中的β-甲基羊毛硫氨酸突变为羊毛硫氨酸，T8S突变体的抑菌活性比野生型乳链菌肽略低，抑菌谱及溶解性与乳链菌肽相同，但在中性或碱性pH以及高温条件下，T8S比野生型乳链菌肽有更好的稳定性。 4、目前，关于铰链区的研究较少，铰链区在nisin的生物活性和孔道形成中起重要作用，已成为人们近来研究的热点，对铰链区结构与功能系统的研究尚未见报道。我们构建的16个铰链区突变体的SDS-PAGE电泳表明K22E不分泌，N20E和M21E分泌痕量，其余突变体及阳性对照都能大量分泌表达。 铰链区突变体的抑菌活性和最小抑菌浓度测定结果为：突变体N20E和M21E产量很低，几乎完全丧失活性：N20H、N20Q、M21G、M21H、K22G、K22H、N20K／M21K和N20F／M21L／K22Q对M．flavus的抑菌活性均有下降，MIC值是野生型nisimZ的1～2倍，对S．thermophilus，它们的MIC值是nisinZ的348倍；而N20K和M21K显示与nisinZ相似的抑菌活性。 抑菌谱：对于革兰氏阳性菌，16个突变体的生物活性与nisinZ基本一致。而对于革兰氏阴性菌，N20K和M21K突变体的抑菌谱发生了变化，它们都对Shigella、NISin生物合成基因簇的克隆及，ll’sZ启动子和结构基因的结构与功能研究Ps，oudomo)。，和Salnonella产生了抑菌活性，这表明在铰链区引入的正电荷使乳链菌肤对一些革兰氏阴性菌具有抑制活性起重要作用。这是一个未见报道的有意义的试验结果，其作用机制尚不清楚。这一发现暗示可以通过定点突变的方法改变乳链菌肤的抑菌谱，以获得对大量革兰氏阴性菌有抑菌活性的新的抗菌素。 稳定性:NZOF、N20H、N20K、N20V、MZ IH、MZIK、K22G、K22H、N20K/M21K、NZoF/MZ 1 LzK22Q和NZoA/MZI幻Dhb/K22G的稳定性与野生型乳链菌肤相似;N20Q和MZ IG在高温和中性或碱性pH条件下比乳链菌肤具有更高的稳定性。 溶解性:在pHZ一5，N20K、N20H、MZIK、MZIH和NZoK/MZIK的溶解度比nisinz高，最大的溶解度分别为，lisinZ 1 6mg/ml、N20K 22mg/ml、N20H 20mg/ml、MZ 1 K 24.5mg/lnl、 MZIH 20:ng/lnl、NZo幻MZIK 19mg/lnl，而其余的8个突变体的溶解度与nisi忆相似。在pH大于5，N20H和MZIH的溶解度略低于nisinZ。值得注意的是，N20K和M21K突变体显示了相当高的溶解性，它们可滴定的pK值也提高了。在pHS时，N20K和MZ IK的溶解度分别为nisinZ的3倍和5倍。 N20K和MZ IK的即一HPLC结果显示它们的纯度达97%以上。N20K和M21K的’H一NMR谱除突变残基外，它们的三级结构与野生型nisinz完全相同。CD谱及UV吸收谱表明N20K和MZ IK突变体与野生型nisinz的二级结构非常相似，在波长210一220nnl区突变体N20K和MZIK与野生型nisinZ的CD谱强度不同，根据a一helix值计算结果，可知NZOK和MZ IK的a一helix值均比野生型nisinZ的a一helix值略有提高，但不足以引起蛋白质二级结构的严重改变。我们推测可能这一轻微的改变是N20K和MZ IK突变体对一些革兰氏阴性菌具有抑菌活性的原因，具体机理有待进一步研究。 5、根据nisZ启动子的特点，构建了分别只含promoterl和只含promoterZ的启动子突变体，以gusA作为报告基因，对其诱导水平和表达强度进行了测定，发现单独的promoterl没有功能，而只含有promoterZ的启动子保留诱导表达功能。对PromoterZ片段的一10区和间隔区进行了定点突变研究，结果表明该间隔区的结构与nisZ启动子的诱导表达功能密切相关。 本论文创新之处: 1、从基因文库中筛选到了完整的乳链菌肤生物合成基因簇。目前许多参