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[目的]探讨人参皂苷Rbl对高糖培养SD大鼠海马神经元GSK3β/IDE信号转导通路及Aβ蛋白表达的影响。[方法]用胰蛋白酶消化法分离出新生24hSD大鼠海马神经元,差速贴壁及密度梯度离心法纯化神经元,采用NSE免疫荧光法对海马神经元进行鉴定。使用DMEM完全培养基培养海马神经元至第3天时,分别加入浓度为50mM、75mM、100mM、125mM、150mM的高糖培养基,于培养24h、48h、72h、96h后用MTT比色实验检测海马神经元活力,以确定最佳的高糖浓度及时间检测点。使用DMEM完全培养基培养海马神经元至第3天时,分别加入含有Rb1浓度为0.1μmol/L(μM)、μM、10μM、100uM的高糖培养基(50maM),培养72h后用MTT比色实验检测海马神经元活力,初步确定Rbl的最佳作用浓度。使用DMEM完全培养基培养海马神经元至第3天时,分别加入含有氯化锂浓度为0.1mmol/L (mM)、1mM、10mM、100mM的高糖培养基(50maM),培养72h后用MTT比色实验检测海马神经元活力,初步确定氯化锂的最佳作用浓度。实验分为4组：正常对照(Con)组、高糖(Glu)组、人参皂苷Rbl(Rbl)组、氯化锂(Licl)组,培养72h后,Western blotting检测其pGSK3β、tGSK3β和IDE蛋白的表达,RT-PCR检测GSK3β、IDE mRNA的表达,ELISA法检测细胞上清液中Aβ蛋白的分泌情况。[结果]1.海马神经元的形态倒置相差显微镜下观察,海马神经元在刚接种时胞体呈体积小的圆形：生长1d后,大部分神经元能伸出三四个短小的突起,基本全部贴壁；4d后,神经元突起增多、增长；7d后,神经元体积继续增大,分支增多,连接成致密的网络。2.海马神经元的鉴定及纯度海马神经元培养3天后,使用共聚焦显微镜检测,镜下观察胞浆和突起呈绿色荧光的为NSE阳性细胞,即神经元；所有细胞胞核均呈蓝色荧光。经VolocityDemo图像分析软件进行分析,每组细胞计数为15-20个,经计算神经元纯度达95%以上。3.MTT比色法实验结果(1)高糖对海马神经元活力的影响：各组0D值与空白对照组的比值(空白对照组的OD均值为0.03)。结果可见Con组的0D值在24h、48h、72h逐渐上升,且48h与24h相比有显著性差异(P<0.01)；各高糖组48h的0D值较24h的0D值显著增加(P<0.01),72h的0D值与48h的OD值相比出现明显下降,其中50mM、125mM、150mM高糖组的OD值与其48h的0D值的差异均具有统计学意义(P<0.01)；72h时,各高糖组0D值与Con组0D值的差异均具有统计学意义(P<0.05),各高糖组OD值之间无明显差异(P>0.05)；96h时各高糖组0D值与其72h的0D值无显著性差异(P>0.05)。(2)Rbl的浓度：与Con组相比,高糖组、0.1μMRb1组、1μMRb1组的0D值存在统计学差异(P<0.01-0.05)；与高糖组相比,0.1μMRb1组、1μMRb1组、10μMRb1组、100μMRb1组的0D值存在统计学差异(均P<0.01)；与1μMRb1组相比,0.1μMRb1组、10μMRb1组、100μMRb1组的0D值存在统计学差异(均P<0.01)。(3)Licl的浓度：与Con组相比,高糖组有统计学差异(P<0.05)；与高糖组相比,lmMLicl组0D值存在统计学差异(P<0.01)；与lmMLicl相比,0.1mMLicl、10mMLicl、100mMLicl组0D值存在统计学差异(均P<0.01)。4. Western blotting检测结果：各组内参蛋白β-action的表达无显著性差异(P>0.05)；与Con组相比,高糖组p/tGSK3β蛋白比值增加,IDE蛋白表达下降(P<0.05)；与Glu组相比,Licl组和Rbl组p/tGSK3β蛋白比值下降,IDE蛋白表达增加(P<0.05)；与Licl组相比,Rbl组p/tGSK3β蛋白比值、IDE蛋白表达增加无明显差异(P>0.05)；四组tGSK3β蛋白的表达无明显差异(P>0.05)。5.RT-PCR检测结果：与Con组相比,高糖组IDEmRNA表达下降(P<0.05)；与高糖组相比,Licl组和Rbl组IDEmRNA表达增加(P<0.05)；与Licl组相比,Rbl组IDEmRNA无明显差异(P>0.05)；四组GSK3βmRNA的表达无明显差异(P>0.05)。6.ELISSA法检测结果：与Con组相比,高糖组细胞上清液中Aβ蛋白的浓度显著上升(P<0.05)；与高糖组相比,Rbl组和Licl组细胞上清液中Aβ蛋白的浓度明显下降(P<0.05)；与Licl组相比,Rbl组细胞上清液中Aβ蛋白的浓度无明显差异(P>0.05)。[结论]1.采用胰蛋白酶消化法,差速贴壁及密度离心法分离、纯化神经元,经NSE免疫荧光法鉴定,可获得纯度为95%的海马神经元,建立原代培养模型。2.50mmol/L高糖可显著抑制海马神经元活性,1μM Rb1能减轻高糖的抑制作用。1mMLicl存在明显的保护作用。3.高糖培养条件中海马神经元pGSK3β/tGSK3β比值升高,IDE蛋白及mRNA表达下降,细胞上清液中Aβ蛋白含量升高。4.中药单体Rbl干预能够显著改善上述变化,其作用与Licl无明显差别。5.中药单体Rbl可能通过减少GSK3β的磷酸化,下调pGSK3β/GSK3β的比值,上调IDE的表达,从而减少海马神经元Aβ蛋白的分泌。[创新点]首次开展中药对高糖环境中培养的海马神经元PI3K/GSK3β信号转导通路及IDE影响的研究。