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黑色素瘤是一种恶性高转移肿瘤,已经严重威胁人类的生命健康。尽管目前针对黑色素瘤,科研人员已经开发了多种治疗手段,但在临床实践中,该类肿瘤在手术或化疗后的复发率及患者存活率都十分低。为解决这一困境,本课题基于立体抗癌策略,采用化疗和免疫治疗联合用药治疗黑色素瘤,提高肿瘤患者的治愈率。基于黑色素瘤高表达乙酰肝素酶-1的特性,本课题制备了酶响应型智能纳米粒(PTX/Alloferon-1 NP),实现了化疗药物紫杉醇(paclitaxel,PTX)和免疫治疗药物alloferon-1的共载,在治疗效果上PTX/Alloferon-1 NP的抗肿瘤效果远超于其它组,这证明本课题实现了化疗和免疫治疗的高效联合应用,课题结论对于免疫化疗联合治疗在黑色素瘤中的应用以及其临床转化具有重要的指导意义。本课题主要内容包括:PTX/Alloferon-1 NP的制备、表征及体外性质研究(相关纳米制剂的制备及处方筛选、物理化学性质表征、荧光共定位研究、血清稳定性研究、酶降解研究和体外释放研究);相关纳米制剂的体外细胞学研究(B16F10细胞的培养、细胞摄取实验、细胞毒性实验、细胞凋亡实验和细胞周期实验);相关纳米制剂的体内分布研究和药效学研究(动物肿瘤模型的建立和实验分组、活体成像及离体器官药物分布研究、小鼠体内抗肿瘤活性研究、小鼠肿瘤组织TUNEL凋亡检测和小鼠肿瘤组织Ki-67增殖检测);相关纳米制剂的体内免疫机制研究和安全性评价(免疫荧光染色确定alloferon-1的体内作用机制、主要器官HE染色研究和血液学研究)。本课题主要结论包括:PTX/Alloferon-1 NP中的关键质量比包括PTX/DOTAP=1:12、protamine/heparin=13.82/80、(heparin/protamine)/DOTAP=4.85:1。TEM照片显示PTX/Alloferon-1 NP的外观圆整且分布均一,动态光散射测得其平均粒径为 106.1±1.113nm(0.147±0.005),ζ-电位为-45.1±0.455mV,有助于提高其低温储存时的稳定性,以及避免其在血液循环时产生溶血效应,增强血液循环时的安全性和稳定性。酶降解实验和体外释放研究证明PTX/Alloferon-1 NP会在酶降解作用和电解质的离子扩散作用的联合作用下,快速实现电荷翻转、粒径减小的变化过程,其有利于纳米粒渗透到黑色素瘤内部以实现更好的疗效。PTX/Alloferon-1 NP的体外细胞学研究证明了纳米制剂更易诱发细胞的内吞作用,游离PTX组、游离combo组、PTX NP组和PTX/alloferon-1 NP组的IC50分别为 57.22μg/mL、52.49μg/mL、14.42μg/mL 和 13.16μg/mL,这证明 PTX/Alloferon-1 NP更易对B16-F10细胞造成毒性,后续的细胞凋亡实验和细胞周期实验对此进行了验证和机制探究。PTX/Alloferon-1 NP的体内分布研究和药效学研究证明了PTX/Alloferon-1 NP在肿瘤部位有明显富集,且通过抑瘤率实验对各制剂组的体内药效学进行相应评价,结果显示PTX/alloferon-1 NP组具有最好的抑瘤效果,对小鼠的生存期实现了大幅度的延长,且同时不会对小鼠的正常体重增长产生影响。随后肿瘤组织切片的TUNEL荧光染色和Ki67组化染色也从机制层面上对抑瘤率实验结果进行了阐释。PTX/Alloferon-1 NP的体内免疫机制研究证明了alloferon-1不能直接杀死肿瘤细胞,只能通过激活NK细胞,从而逆转激活肿瘤微环境中被抑制的其它免疫细胞,以实现对肿瘤的杀灭。体内安全性评价实验结果证明游离的PTX会对小鼠的肝脏、脾脏、肺和肾脏造成严重伤害,而PTX/Alloferon-1 NP则没有器官毒性。以上结果表明,本课题制备的PTX/Alloferon-1 NP对高表达乙酰肝素酶-1的黑色素瘤具有很好的特异响应性,其包载的PTX和alloferon-1能对黑色素瘤起到很好的抑制作用,实现了免疫疗法和化疗的高效联合应用,为该纳米制剂的临床转化提供了理论依据和实验基础。