Anammox对磺胺甲恶唑的抵抗机理及生物转化研究

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在众多生物脱氮技术中,厌氧氨氧化(Anammox)属于一类新兴高效的工艺,具备能耗低、污染少的优点,在生物脱氮领域有着广阔的发展前景。但实际含氮废水中可能存在种类繁多的抗生素,而抗生素的抑菌性而对Anammox的工程应用可能存在着一定的威胁,然而已有研究大多考虑极高浓度抗生素的抑制,或者仅停留在表观分析,对抗生素的转化分析了解甚少。因此,本文通过富集培养获得活性更高的厌氧氨氧化菌(AnAOB);在此基础上,研究了磺胺甲恶唑(SMX)在短期高SMX浓度和长期(0.25~5 mg/L SMX)两种体系下对Anammox工艺脱氮性能的影响;对Anammox颗粒污泥的EPS成分、代谢关键酶活、内外形貌变化、微生物菌群结构变化、功能基因及抗性基因(ARGs)的响应等多层面剖析了SMX对Anammox的抑制机理;同时探究了SMX在Anammox系统内的转化路径及产物,结合宏观分析与微观机理研究,确定了Anammox系统在抗生素SMX胁迫下的自我适应和抵抗机制。(1)短期胁迫下批次实验确定了SMX对厌氧氨氧化颗粒的IC50为291.64mg/L。长期胁迫过程中微量浓度(≤0.5 mg/L)的SMX对厌氧氨氧化系统的脱氮性能未造成显著的影响,提升浓度后脱氮性能有所降低,但都能在10 d左右恢复正常状态,最终反应器能在5 mg/L的SMX浓度下稳定运行,脱氮效率(NRE)稳定保持在95.7±0.5%;而厌氧氨氧化活性同脱氮性能的受抑制周期相吻合,适应后能恢复且略高于初始水平。(2)SMX胁迫后能发现颗粒污泥中的胞外聚合物(EPS)和蛋白(PN)含量呈显著上升趋势,并进一步揭示了EPS与SMX之间的相互作用,推测EPS中丰富的蛋白会与SMX发生结合形成相关络合物,以缓解抗生素的胁迫;关键性酶活等会受到不同程度的干扰,但具备自适应和恢复能力,从生理代谢功能层次证明了厌氧氨氧化系统对环境浓度SMX的耐受性及稳定性;颗粒污泥的疏水性呈上升趋势,颗粒污泥倾向于聚集;扫描电镜(SEM)表征发现胁迫后样品的细胞间覆盖大量胞外聚合物(EPS),透射电镜(TEM)表征发现厌氧氨氧化菌外部形态规则度降低,内部的厌氧氨氧化体出现了明显的皱缩,将更利于相关酶的堆积和物质传递,从形貌变化推测颗粒抵抗SMX抑制作用的机理,初步阐释Anammox-EGSB反应器脱氮性能保持稳定的原因。(3)Anammox-EGSB反应器中SMX的去除率在适应后稳定在60%左右,在Anammox-EGSB反应器出水中共找到SMX所可能形成的11种转化产物,转化途径主要是通过SMX分子的磺酰胺键S-N、C-N键和S-C键断裂等方式所形成的。通过大肠杆菌活性指标,发现反应器出水的毒性已经显著低于进水的毒性,证明厌氧氨氧化系统处理环境浓度SMX的含氮废水是可以兼顾稳定脱氮与一定的SMX去除及生物毒性减弱功能的。(4)根据群落结构变化发现微生物群落在核心菌群的基础上进行了较大的自主调整;添加SMX后,AnAOB所属的浮霉状菌门门丰度增加,在属水平上,Candidatus_Jettenia的丰度处于上升趋势,表明其具有一定的SMX耐受性,三种AnAOB丰度变化较大,但AnAOB总丰度能维持在较稳定水平。同时能发现Limnobacter、Pseudoalteromonas等可能充当保护角色的菌种丰度水平稳定增高,也发现了一些可能具备SMX降解能力的菌种。从功能基因的整体表达丰度差异推测抵抗机理;Candidatus_Brocadiaceae是这些主要功能的贡献者,最终贡献度上调10%,表明系统可能会通过强化核心菌群功能基因表达来缓解抑制。nir S、hzs A和hdh基因表达都呈先下降后逐渐上升的趋势,酶活性降低时细菌会在相关基因上进行更多表达以抵消这种抑制作用;空白组和SMX组对比发现后者新增了15种抗生素抗性基因(ARGs),且磺胺类sul1抗性基因的丰度水平上调,表明ARGs可能也是一种抵抗SMX的方式。此外,sul1抗性基因在Candidatus_Jettenia和Candidatus_Kuenenia中贡献度呈现上升趋势,表明基因水平转移能使AnAOB具备SMX抗性,保证系统厌氧氨氧化功能的正常进行。综上,本文结合宏观事实与微观机理,发现厌氧氨氧化系统脱氮性能可以在SMX浓度梯度递增的驯化过程中保持稳定,通过胞外聚合物分析、代谢关键酶活测试、颗粒及菌体形貌、亲疏水性等指标测试,同时结合高通量测序方法,从微生物群落结构、COG功能基因、代谢功能基因及ARGs变化等层次,深度挖掘并推测厌氧氨氧化系统对抗生素的自我保护和抵抗机制,为今后的实际应用提供有力的数据支撑。
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