论文部分内容阅读
第一部分:基于基因组学及网络药理学分析胆汁淤积主要致病机制及黄芩苷潜在治疗靶点预测目的:通过基因组学和网络药理学手段深入挖掘胆汁淤积发病机制,并探究黄芩苷抗胆汁淤积的潜在作用靶点。方法:采用SD大鼠,通过连续5天皮下注射5 mg/kg 17α-乙炔雌二醇（17α-Ethynylestradiol;EE）构建CLI大鼠模型,并同时灌胃给予黄芩苷（200 mg/kg）,每日一次。记录大鼠体重变化,计算肝重/体重比;胆管插管收集各组大鼠胆汁,计算胆汁流量;检测大鼠血清肝功能生化指标（ALT、AST、AKP）和总胆汁酸（TBA）水平;大鼠肝脏组织行H＆E染色;利用基因表达谱芯片和Dis Ge NET数据库,获取CLI大鼠肝脏差异变化基因和人类胆汁淤积疾病相关基因;使用Swiss Target Prediction在线数据库预测黄芩苷的作用靶点;利用韦恩图软件,求人类胆汁淤积疾病和黄芩苷作用靶点交集基因;采用DAVID数据库进行GO和KEGG分析;采用String平台分析蛋白相互作用,并结合Cytoscape 3.8.2软件构建蛋白-蛋白相互作用网络图。结果:（1）CLI大鼠血清ALT、AST、AKP、TBA水平显著升高,胆汁流量降低,肝脏组织出现水肿和局部坏死。从CLI大鼠肝脏差异基因和人类胆汁淤积疾病基因数据分析来看,胆汁淤积的发病机制复杂,主要涉及初级胆汁酸（Bile acids;BAs）合成、BAs分泌和转运相关通路改变;同时疾病靶基因涉及炎症、氧化应激、细胞凋亡等生物过程;另外,有细胞膜、线粒体、内质网、细胞核等多种细胞组分参与。（2）黄芩苷对CLI大鼠具有明显的肝保护作用,可显著降低肝指数,减轻血清ALT、AST、AKP、TBA水平,增加胆汁流量,减轻肝脏组织异常病理变化。黄芩苷可调控多靶点多通路,并参与多种生物学过程。（3）黄芩苷潜在抗胆汁淤积作用靶基因富集在叉头转录因子信号、ABC转运体、胆汁分泌等多个信号通路。此外,MAPK、CAT、SIRT1是黄芩苷较具潜力的抗胆汁淤积作用靶点。结论:CLI发病涉及多个信号通路和多个细胞组分的改变,可能与BAs合成、分泌和转运过程障碍有关;黄芩苷具有显著的抗胆汁淤积效果,且黄芩苷药理作用广泛,具有多靶点多通路调控的特点;MAPK、CAT、SIRT1是其潜在抗胆汁淤积作用靶点。第二部分:黄芩苷通过调节SIRT1/HNF-1α/FXR通路恢复CLI大鼠肝脏BAs稳态目的:基于SIRT1/HNF-1α/FXR通路探究黄芩苷对CLI大鼠肝脏BAs稳态的调节作用。方法:采用5 mg/kg EE连续皮下注射5天构建CLI大鼠模型,同时灌胃给予黄芩苷（200 mg/kg）。LC-MS/MS法检测大鼠肝脏BAs含量;利用RT-PCR和Westernblot检测大鼠肝脏BAs合成、代谢、转运相关蛋白的表达水平;检测BAs关键核受体的表达水平;分子对接预测黄芩苷与SIRT1之间的相互作用,并检测SIRT1/HNF-1α信号通路的表达水平。采用EE（10μM）刺激Hep G2细胞,并给予黄芩苷（20,40,80μM）,CCK8法检测细胞活性;同时结合sh-sirt1,采用RT-PCR和Westernblot评价黄芩苷对SIRT1/HNF-1α/FXR信号通路的调控作用。结果:黄芩苷显著恢复CLI大鼠肝脏BAs池的组成。进一步研究发现黄芩苷上调CLI大鼠肝脏BAs合成酶（CYP27A1）和代谢酶（Bal、Baat、Sult2a1）的表达。此外,黄芩苷促进CLI大鼠肝脏BSEP和MRP2的表达（BAs外排转运体）,并进一步抑制CLI大鼠肝脏NTCP的表达（BAs摄取转运体）。分子对接结果显示黄芩苷与SIRT1之间存在较强的亲和力。而且,机制结果表明黄芩苷可显著激活CLI大鼠肝脏SIRT1/HNF-1α/FXR信号通路。体外实验证实黄芩苷剂量依赖性地促进SIRT1表达,且SIRT1基因沉默可阻断黄芩苷对SIRT1/HNF-1α/FXR通路的激活及对FXR下游靶基因的调控作用。结论:黄芩苷通过激活SIRT1/HNF-1α/FXR通路恢复CLI大鼠肝脏BAs稳态,保护EE诱导的CLI大鼠肝损伤。第三部分:黄芩苷通过激活SIRT1/Nrf2信号改善CLI大鼠肝脏氧化应激损伤目的:基于SIRT1/Nrf2通路探究黄芩苷抗CLI大鼠肝脏氧化应激损伤的作用。方法:采用EE（5 mg/kg）连续皮下注射5天构建肝内CLI大鼠模型,同时灌胃给予黄芩苷（200 mg/kg）。检测大鼠血清及肝脏SOD、MDA和GSH水平及肝脏ROS的水平;TUNEL法评价各组大鼠肝细胞凋亡情况,同时检测凋亡通路蛋白（Bax、Bcl-2、C-caspase 3/caspase 3）的表达水平;检测氧化应激通路基因和蛋白（HO-1、GCLC、GCLM、NQO1）的表达水平;检测SIRT1/Nrf2通路的蛋白表达。体外实验利用Hep G2细胞,给予EE（10μM）和黄芩苷（80μM）,评价细胞的ROS水平和凋亡水平,同时结合si-sirt1敲低SIRT1,评价黄芩苷对SIRT1/Nrf2信号通路的作用。结果:黄芩苷能明显改善CLI大鼠血清和肝组织中SOD、GSH和MDA的异常变化。同时,黄芩苷降低CLI大鼠肝脏ROS水平及细胞凋亡。机制研究结果显示黄芩苷诱导SIRT1和Nrf2的核易位,并促进抗氧化应激蛋白（HO-1、GCLC、GCLM、NQO1）的表达。同样,在Hep G2细胞中,黄芩苷能够激活SIRT1/Nrf2信号,并抑制EE诱导的ROS增加和细胞凋亡,敲低SIRT1可阻断黄芩苷的上述肝细胞保护作用。结论:黄芩苷通过激活SIRT1/Nrf2信号缓解CLI大鼠肝细胞氧化应激和凋亡。