目的:急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia ALL)为一类恶性、克隆性疾病,以骨髓的造血干祖细胞增殖失控、分化障碍以及凋亡受抑等为特点,近年来,该病的发病率有增高趋势,尽管现阶段,经过药物化疗后,该病的缓解率明显升高,但由于多药耐药问题的存在,其复发率亦较前升高。miRNA作为一种内源性的非编码RNA,通过与其相对应的靶基因的3’末端的非编码序列进行结合,导致与靶基因相对应的mRNA直接被降解掉或是其翻译过程受到抑制,从而达到在转录后的分子水平,对其对应靶基因的相对表达水平进行一系列调控的目的。在众多miRNA中,MiR-149已被研究发现在多种恶性疾病中异常表达,其中,JunBmRNA被认为是miR-149在白血病细胞中的直接靶点之一,miR-149在白血病细胞中异常表达,通过靶向调控JunBmRNA的表达,进而参与多种白血病的发生、发展过程。JunB蛋白是活化蛋白转录因子的主要成分,参与细胞有丝分裂、细胞周期及凋亡通路的调控、信号分子的传递等多个过程,在恶性肿瘤的侵袭、转移等过程中亦发挥着作用。目前关于miR-149在白血病Jurkat细胞株中表达水平的研究极少、尚无关于JunB mRNA的表达水平及其作用的研究。为了探讨miR-149对Jurkat细胞的增殖、凋亡等方面的影响及其可能的相关作用机制,为未来医学界对白血病的临床治疗提供更多依据,故而设计了本次实验。方法:人工合成miRNA-149的反义寡核苷酸序列、与人类基因序列无同源性的阴性对照序列NC(交由生物公司合成);通过脂质体转染法(均以Lipofectamine 2000为介导),将miRNA-149反义寡核苷酸序列以及NC序列分别转染至Jurkat细胞中;通过Real-time PCR法检测转染后Jurkat细胞中miR-149及JunB mRNA表达水平;通过MTT法及流式细胞术,检测转染miRNA-149反义寡核苷酸序列后对Jurkat细胞增殖、凋亡的影响;进一步通过Western-Blot法,检测转染miRNA-149反义寡核苷酸序列对JunB蛋白表达量的影响。结果:1.设计合成的miR-149反义寡核苷酸序列能够有效沉默Jurkat细胞内miR-149的表达,与空白对照组相比,实验组miR-149表达水平明显降低(0.401±0.065 vs 1.021±0.145),JunB mRNA 表达水平明显升高(1.003±0.072 vs 0.164±0.013),二者差别均有统计学意义(P<0.05);转染阴性序列组Jurkat细胞内miR-149及JunB mRNA表达水平均未见明显变化(0.998±0.234 vs 1.02±0.1453,0.153±0.014vs0.164±0.013),二者差别均无统计学意义(P>0.05)。提示本实验成功合成了能够有效沉默miR-149基因表达的反义寡核苷酸序列,并使得JunB mRNA的表达水平上调,所合成NC序列与人类基因组无同源性,可应用于下一步实验。2.流式细胞术和MTT法检测转染miR-149反义寡核苷酸序列后,相比于空白对照组,Jurkat细胞凋亡率明显升高,存活率明显降低,二者差别均有统计学意义,而转染NC序列组细胞凋亡率无明显变化,二者差别无统计学意义。提示miR-149反义寡核苷酸序列能抑制Jurkat细胞的增殖。3.Western Blot法检测各实验组JunB蛋白表达水平变化可知,与空白对照组相比,转染miR-149反义寡核苷酸序列后,JunB蛋白表达量升高(0.798±0.013 vs 0.116±0.003),差别有统计学意义(P<0.001),NC 组中 JunB蛋白表达量(0.152±0.004vs0.116±0.003),P>0.05,差异无统计学意义。本实验结果与Real-time PCR结果相符,提示设计合成的miR-149反义寡核苷酸序列能够特异性有效上调Jurkat细胞中JunB mRNA的表达,进而使JunB蛋白表达量升高。结论:1.本实验设计合成的miR-149反义寡核苷酸链能够抑制Jurkat细胞内miR-149的表达,上调JunB mRNA的表达水平;2.转染miR-149反义寡核苷酸,使JunB蛋白表达量升高;3.转染miR-149反义寡核苷酸,能够显著抑制Jurkat细胞增殖、促进其凋亡,其机制可能是通过激活细胞内与凋亡相关的信号通路实现的。