论文部分内容阅读
目的:通过体外实验研究臭椿酮对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖、细胞周期分布及凋亡的影响,并初步探讨其可能的抗肿瘤机制,为临床鼻咽癌的治疗提供新的候选药物。方法:（1）采用MTT法检测臭椿酮对人鼻咽癌CNE-2细胞体外生长的抑制作用:体外培养人低分化鼻咽癌CNE-2细胞,分别用不同浓度的臭椿酮（0、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2μM）处理细胞24、48和72小时后,分别测定不同浓度梯度及不同时间梯度时的光密度值（Optical density,OD）,并根据此OD值计算细胞存活率及不同时间（24、48和72小时）的半数抑制浓度(IC50);（2）采用Hoechst 33342荧光染色法观察臭椿酮对人鼻咽癌CNE-2细胞凋亡形态的影响:根据MTT法检测结果,选取合适的药物浓度（0、1.6、3.2和6.4μM）分别处理人鼻咽癌CNE-2细胞48小时,并进行荧光染色,于荧光倒置显微镜下观察并拍照记录药物干预后细胞凋亡形态的变化;（3）采用流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）检测不同浓度臭椿酮对人鼻咽癌CNE-2细胞周期分布及细胞凋亡的影响:以上述药物浓度（0、1.6、3.2和6.4μM）分别处理人鼻咽癌CNE-2细胞48小时,分别经Annexin V-FITC/PI双染法染色和PI单染法染色后,通过流式细胞仪检测不同浓度梯度下的细胞凋亡率和细胞周期分布情况;（4）采用蛋白质免疫印迹法（Western Blot,WB）检测臭椿酮对人鼻咽癌CNE-2细胞内凋亡相关蛋白表达水平的影响:以上述药物浓度（0、1.6、3.2和6.4μM）分别处理人鼻咽癌CNE-2细胞48小时后提取总蛋白,通过western blot检测Bcl-2、Bax及caspase-3凋亡相关蛋白的表达情况,并通过Image Lab软件进行结果分析。结果:（1）MTT法检测结果显示,不同浓度臭椿酮分别处理人鼻咽癌CNE-2细胞相应时间后,随着臭椿酮药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞存活率逐渐降低,且不同时间（24、48和72小时）的IC50分别为（0.66±0.07）μM、（0.37±0.05）μM和（0.23±0.01）μM;（2）Hoechst 33342荧光染色结果显示,对照组的人鼻咽癌CNE-2细胞为浅蓝色的均匀荧光染色,而臭椿酮处理组的人鼻咽癌CNE-2细胞呈现亮蓝色的强荧光染色,可见典型的细胞凋亡形态,并且凋亡细胞数目随药物浓度的递增呈上升趋势;（3）流式细胞术检测结果显示,不同浓度的臭椿酮处理人鼻咽癌CNE-2细胞48小时后,Annexin V-FITC/PI双染法结果提示,与对照组比较,臭椿酮处理组的人鼻咽癌CNE-2细胞凋亡率增加,且细胞凋亡率随药物浓度的增加呈上升趋势;PI单染法提示臭椿酮处理组的人鼻咽癌CNE-2细胞G2/M期细胞比例较对照组增加,且G2/M期细胞比例随臭椿酮浓度的增加而增加;（4）Western Blot结果显示,经不同浓度臭椿酮处理48小时后,与对照组比较,随臭椿酮浓度的增高,细胞内的促凋亡蛋白Bax及caspase-3的表达量逐渐升高,而抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量则逐渐减少。结论:臭椿酮对人鼻咽癌CNE-2细胞有明显的增殖抑制作用,呈浓度和时间依赖性,并通过诱导细胞凋亡及细胞周期G2/M期阻滞发挥其抗鼻咽癌作用,其机制可能是臭椿酮具有上调细胞内Bax及caspase-3蛋白表达量,同时下调Bcl-2蛋白表达量的作用,这可能与激活线粒体介导的细胞凋亡通路及死亡受体介导的细胞凋亡通路有关,具体的抗肿瘤机制有待进一步探究。总之,臭椿酮作为天然活性提取物,对鼻咽癌细胞表现出显著的抗肿瘤活性,其可能成为抗鼻咽癌治疗的潜在候选药物。