丙酮丁醇梭菌是一种革兰氏阳性、严格厌氧的梭菌属细菌。该细菌在对数生长早、中期以乙酸和丁酸为主要产物（产酸阶段），在对数生长后期和稳定生长期以丙酮、丁醇及乙醇为主要产物（产有机溶剂阶段）。随着生物能源技术的发展，丙酮丁醇梭菌的有机溶剂合成机理及其在工业上的应用正日益受到科学界的广泛重视。蛋白质磷酸化修饰是自然界广泛存在的一种翻译后修饰形式，是调控细胞内信号和代谢通路的重要方式。磷酸化肽段富集和高精度质谱鉴定等技术的发展，极大地推动了磷酸化蛋白质组学的研究。近年来，有足够的实验证据表明原核生物内也存在着较为丰富的蛋白质磷酸化现象。然而，有关丙酮丁醇梭菌的磷酸化蛋白质的研究鲜有报道，磷酸化蛋白质与该细菌的代谢活动的关系更无从了解。　　本研究以野生型丙酮丁醇梭菌ATCC824菌株为对象，采用了亲和蛋白质组技术较为系统地分析了该细菌在产酸和产有机溶剂阶段的磷酸化蛋白质组，并探索了某些蛋白质的磷酸化与代谢通路之间的关系。　　在本研究中，丙酮丁醇梭菌的产酸和产有机溶剂阶段首先通过pH测定和产物含量分析被确定。我们收集了这两个特征生长阶段的细菌，并提取了全细菌蛋白质。将这些蛋白质进行双向电泳分离后，我们观察到许多分子量接近，但等电点差异明显的“串珠”斑点;进一步利用基质辅助激光解析-飞行时间质谱技术，发现某些“串珠”斑点含有磷酸化修饰信号。为了全面分析丙酮丁醇梭菌中的磷酸化蛋白质组，我们采用二氧化钛为富集磷酸化修饰肽段的亲和材料，测试了不同色谱条件下细菌磷酸化肽段的富集效率;应用离子阱质谱仪，分别鉴定了在两个生长阶段中所能富集的磷酸化肽段。在所分析的样本中，共鉴定了82条不同的磷酸化肽段，分属于61个不同蛋白质，其中含有两个及以上磷酸化位点的肽段有16个。在产酸阶段共鉴定到52条不同的磷酸化肽段，分属于44个唯一蛋白质;在产有机溶剂阶段共鉴定到70条不同的磷酸化肽段，分属于51个唯一蛋白质;其中在两个生长阶段均能检测到40个共享磷酸化肽段和34个共享唯一磷酸化蛋白质。生物信息学分析表明，在所鉴定的磷酸化蛋白质中，大约有11％的蛋白质是有机溶剂代谢通路的关键酶类，这提示丙酮丁醇梭菌内蛋白质磷酸化可能参与了有机溶剂合成的调节。　　这些实验结果表明，在产酸阶段乙酸激酶存在明显的磷酸化，而且该酶是一种产酸通路的关键酶，其活性变化与有机溶剂代谢通路的调控关系密切。因此我们深入展开了乙酸激酶磷酸化的功能研究:首先是丙酮丁醇梭菌乙酸激酶的体内实验，通过设计和制备针对乙酸激酶磷酸化肽段的单克隆抗体和Western Blot，确证了乙酸激酶的丰度在两个生长阶段并无明显差异，但是在产酸阶段磷酸化修饰水平显著高于产有机溶剂阶段;通过测定乙酸激酶的特异催化反应，发现了乙酸激酶在产酸阶段的催化活性是产有机溶剂阶段的1.9倍。我们进一步在体外实验中分析了磷酸化位点对乙酸激酶催化活性的影响。采用分子生物学的方法，永久磷酸化和非磷酸化突变的乙酸激酶重组蛋白被成功构建;酶活性测定实验证实了当239位苏氨酸发生永久磷酸化修饰突变后，其催化活性较非磷酸化形式提高了2.1倍。因此，无论体内还是体外实验证据都提示乙酸激酶磷酸化可显著影响它的催化活性，而乙酸激酶活性的改变可能调节整个产有机溶剂的代谢通路。　　本研究采用亲和蛋白质组技术，首次证明了丙酮丁醇梭菌中存在广泛的蛋白质磷酸化现象，其中许多磷酸化蛋白质参与了产酸和产有机溶剂的代谢通路;通过对乙酸激酶磷酸化的功能比较、分析，首次揭示了丙酮丁醇梭菌内蛋白质磷酸化可能是调节该细菌代谢途径的一种有效方式。