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背景骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种常见的退行性疾病,以进展性软骨细胞凋亡与软骨降解为特征。Wnt/β-catenin信号传导通路的激活可引起软骨细胞凋亡和软骨降解,在骨关节炎的发生发展中发挥着关键作用,被认为是可以有效治疗骨关节炎的靶点之一。但是目前骨关节炎的主流药物治疗,存在治疗效果不确切及副作用较大等问题,以单纯控制症状为主,大大制约了临床应用。而中草药因其治疗效果好、一般毒副作用小、可长期使用且成本较低,引起了研究者的极大兴趣。诸多研究显示,一些从传统的中药中提取的活性成分通过下调炎症介质水平,阻断炎症信号传导通路,促进软骨细胞增殖,抑制软骨细胞凋亡,维持软骨细胞外基质稳态及抗氧化等机制实现抗骨关节炎作用。本研究通过发现骨关节炎中表达异常的去泛素酶USP49,寻求能有效抑制软骨细胞凋亡及软骨降解的中药活性成分,并探索其具体作用机制,为开发新型骨关节炎治疗药物打下实验基础。第一部分USP49抑制IL-1β诱导的软骨退变目的了解USP49对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡及细胞外基质降解的影响。方法首先基于GSE57218数据库了解USP49在骨性关节炎患者中的表达水平。原代培养大鼠关节软骨细胞,并通过Collagen II和SOX9免疫荧光鉴定。分别使用0、5、10、20 ng/m L的大鼠重组IL-1β蛋白预处理原代培养的软骨细胞,CCK-8测定软骨细胞增殖,RT-PCR检测USP49基因表达,Western blot测定USP49蛋白水平后,选择合适的IL-1β浓度模拟骨关节炎进行实验。通过过表达USP49质粒转染原代软骨细胞,构建USP49过表达软骨细胞,使用RT-PCR及Western blot验证转染效果。随后,使用10 ng/m L的重组IL-1β蛋白处理USP49过表达软骨细胞,流式检测软骨细胞凋亡,Western blot测定USP49、β-catenin、抗凋亡蛋白Survivin及软骨降解相关蛋白MMP-1、MMP-13表达。结果基于GSE57218数据库分析发现,较正常人样本,USP49在骨性关节炎患者中表达显著降低。通过Collagen II和SOX9免疫荧光鉴定的原代软骨细胞,经不同浓度IL-1β预处理后,检测发现细胞增殖和USP49表达明显抑制,且随浓度增加,抑制作用增强。10ng/mL的IL-1β已具有显著作用,选择该浓度进一步实验。使用USP49过表达质粒转染软骨细胞,经验证显示USP49表达明显上调。流式细胞仪检测发现USP49过表达显著减弱IL-1β诱导的细胞凋亡,上调抗凋亡蛋白Survivin表达,抑制β-catenin蛋白及软骨降解相关蛋白MMP-1、MMP-13表达。小结USP49可能通过Wnt/β-catenin信号传导通路抑制软骨细胞凋亡及细胞外基质降解,减轻IL-1β诱导的软骨退行性改变。第二部分6-姜酚上调USP49抑制IL-1β诱导的软骨退变目的探索6-姜酚对骨关节炎软骨细胞凋亡及软骨降解的影响及其具体机制。方法从黄芩苷、芍药苷、姜黄素、6-姜酚、松果菊苷及黄芪甲苷中筛选出上调USP49表达最明显的中药活性成分（6-姜酚）。随后,使用不同浓度的6-姜酚（0、5、10和20μmol/L）处理IL-1β诱导的软骨细胞,流式检测软骨细胞凋亡,Western blot测定USP49、β-catenin、Survivin及软骨降解相关蛋白（MMP-1,MMP-13）的表达。通过si RNA转染构建敲低USP49基因软骨细胞并验证转染效率,选择敲低作用最强的细胞进行下步实验。使用Wnt/β-catenin抑制剂XAV939和6-姜酚分别处理USP49敲低软骨细胞后,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测β-catenin、Survivin、MMP-1和MMP-13的蛋白表达。结果经过筛选,发现6-姜酚可显著抑制IL-1β的诱导作用,明显促进USP49的表达。不同浓度的6-姜酚处理IL-1β诱导的软骨细胞后,流式细胞仪、Western blot发现6-姜酚可明显抑制IL-1β诱导的细胞凋亡及β-catenin蛋白表达,上调USP49与Survivin并下调软骨代谢相关蛋白MMP-1、MMP-13表达。成功构建USP49敲低软骨细胞后,结果显示敲低USP49致软骨细胞凋亡显著增加,下调Survivin蛋白,并上调β-catenin,MMP-1及MMP-13蛋白表达。进一步研究发现,6-姜酚和XAV939能够强有力地抵消USP49敲低的作用,可显著抑制细胞凋亡,上调Survivin表达,并下调β-catenin及MMP-1,MMP-13等软骨降解相关蛋白表达。小结6-姜酚通过上调USP49表达调控Wnt/β-catenin信号转导通路,抑制软骨细胞凋亡及软骨降解相关蛋白MMP-1,MMP-13的表达,进而缓解IL-1β诱导的软骨退行性改变。第三部分USP49通过去泛素化Axin抑制Wnt/β-catenin通路目的研究USP49抑制Wnt/β-catenin信号转导通路的具体作用机制。方法分别通过RT-PCR及Western blot检测USP49过表达及USP49敲低软骨细胞中Axin基因转录及蛋白表达水平。通过免疫共沉淀实验了解USP49与Axin的相互作用。在IL-1β干预下,通过泛素化检测实验了解过表达USP49对Axin泛素化水平的影响。使用蛋白酶体抑制剂MG132作用于IL-1β预处理的USP49敲低软骨细胞,Western blot检测Axin蛋白水平的变化。结果USP49过表达或下调对软骨细胞中Axin蛋白的水平有显著影响,但并不干预Axin m RNA的表达。免疫共沉淀结果显示USP49与Axin存在明确的相互作用,泛素化检测实验发现过表达USP49可显著降低Axin泛素化水平,从而抑制Wnt/β-catenin信号传导通路。进一步实验显示蛋白酶体抑制剂MG132可有效抵消USP49敲低的作用,显著上调Axin蛋白的水平。小结USP49通过去泛素化Axin抑制Wnt/β-catenin信号传导通路的激活,实现抗软骨退行性改变的作用。结论6-姜酚通过USP49去泛素化Axin调控Wnt/β-catenin信号传导通路,抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡及细胞外基质降解,在体外实现对软骨退行性改变的治疗作用。