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微孢子虫作为一种单细胞真核微生物,具有广泛的寄生域,可以感染几乎所有的脊椎动物和无脊椎动物,以及一些原生生物,它的增殖发育主要依赖宿主细胞的营养物质和能量。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）是人类最早被鉴定的微孢子虫,它引起的家蚕微粒子病是蚕桑产业的一大威胁,也是目前蚕桑生产中检疫的主要对象。微孢子虫因为细胞内寄生生活的原因导致其基因组的极大减缩,但是依然保留了用于运输货物分子的内膜系统。在内膜系统中,被膜复合体Ⅱ（coat protein complex Ⅱ,COPⅡ）介导从内质网到高尔基体的蛋白质转运,由Sar1、Sec23、Sec24、Sec13、Sec31组成。目前在微孢子虫内膜转运方面的研究相对较少,对于微孢子虫是否形成COPⅡ囊泡转运货物蛋白,以及在货物运输之外是否还发挥其他作用,至今尚无充分的数据证明。为了了解COPⅡ在家蚕微孢子虫增殖过程中的定位关系和组装机制,本文成功克隆了NbSar1、Nb Sec23、Nb Sec24、Nb Sec13、Nb Sec31基因并制备了NbSar1多克隆抗体,利用间接免疫荧光技术探索了NbSar1在家蚕微孢子虫不同发育时期的定位情况,通过酵母双杂交技术鉴定了NbSar1、Nb Sec23、Nb Sec24、Nb Sec13、Nb Sec31之间的相互作用关系,利用RNAi技术分析了NbSar1、Nb Sec23、Nb Sec24、Nb Sec13、Nb Sec31之间的调控关系,得到的主要研究结果如下:Sar1作为小GTP酶,是调节内质网COPⅡ囊泡形成的核心参与者。生物信息学预测结果显示NbSar1编码215个氨基酸,蛋白质分子质量为28 k Da,等电点为9.26。多重序列比对结果显示NbSar1与东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae XP＿024330127.1）、肠脑炎微孢子虫（Encephalitozoon intestinalis XP＿003072817.1）、兔脑炎微孢子虫（Encephalitozoon cuniculi NP＿597349.1）、蚱蜢脑炎微孢子虫（Encephalitozoon romaleae XP＿0092644 37.1）的Sar1同源性分别为63.89%、57.01%、56.56%和56.56%。系统发育分析结果显示家蚕微孢子虫与东方蜜蜂微孢子虫之间亲缘关系较近。在本研究中,通过家蚕微孢子虫数据库搜索Sar1基因序列,克隆得到是一个完整的ORF,大小为648 bp,没有突变。成功构建重组表达载体p ET-28aNbSar1并体外原核诱导表达得到分子量约为34 KDa的NbSar1重组蛋白。通过超声破碎并用200 mmol/L咪唑洗脱获得纯化的NbSar1重组蛋白。间接免疫荧光结果显示NbSar1主要定位在家蚕微孢子虫的细胞核周围。为了探家蚕微孢子虫COPⅡ蛋白之间的互作关系,本文根据Nb Sec23-1、Nb Sec23-2、Nb Sec24-1、Nb Sec13、Nb Sec31-1、Nb Sec31-2基因序列设计了特异性引物,并克隆得到一个完整的ORF,大小分别为540bp、648bp、648bp、825bp、2463bp、2721bp。结构域预测结果显示家蚕微孢子虫Sec23-1包括Gelsolin结构域,Sec23-2包括zf-Sec23-Sec24结构域、Sec23-trunk结构域。家蚕微孢子虫Sec24-1包括zf-Sec23-Sec24结构域。家蚕微孢子虫Sec13有6个WD40结构域。家蚕微孢子虫Sec31-1和Sec31-2都包括3个WD40结构域,且序列比对结果显示Sec31-2的序列包括Sec31-1的序列。根据蛋白结构域之间的互作关系,通过酵母双杂交技术验证了COPⅡ组分之间的相互作用,结果显示NbSar1与Nb Sec23-2、Nb Sec23-2与Nb Sec24-1、Nb Sec23-1与Nb Sec31-1、Nb Sec13与Nb Sec31-1之间存在相互作用。为了探家蚕微孢子虫COPⅡ蛋白之间的调控关系,本文通过q PCR技术检测RNA干扰NbSar1后的沉默效果,结果表明在注射si RNA后的24h、48h、72h都有明显的敲降效果,而96h已经没有了敲降效果。通过q PCR技术检测RNA干扰NbSar1后,Nb Sec23-1、Nb Sec24-1、Nb Sec13、Nb Sec31-1、Nb Sec31-2表达水平的变化,结果RNA干扰24h、48h、72h后,Nb Sec23-1、Nb Sec24-1、Nb Sec13、Nb Sec31-1、Nb Sec31-2的表达显著异常,提示NbSar1、Nb Sec23-1、Nb Sec24-1、Nb Sec13、Nb Sec31-1、Nb Sec31-2这些基因在家蚕微孢子虫中可能协同发挥作用。RNA干扰NbSar1后,NbSar1蛋白不是均匀分布在家蚕微孢子虫核周区域,而是在家蚕微孢子虫细胞质中以少量点状分布,家蚕微孢子虫的增殖也受到显著抑制。因此,NbSar1蛋白对于COPⅡ的组装以及家蚕微孢子虫的增殖是十分重要的。这些结果都暗示NbSar1、Nb Sec23、Nb Sec24、Nb Sec13、Nb Sec31可能在家蚕微孢子虫中装配形成COPⅡ,并在家蚕微孢子虫增殖过程中协同发挥作用,而NbSar1可能在COPⅡ囊泡形成过程中发挥关键作用,这些研究结果为COPⅡ蛋白亚基的进一步研究奠定了基础,为家蚕微孢子虫致病机制的深入探究和该类病原菌的防治提供了重要参考。