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研究背景与目的：
原发性肝癌是一种全球范围内常见的恶性肿瘤，其中75%-85%的肝癌为肝细胞癌(HCC)。人体肝脏的代偿功能很强大，早期肝癌患者的临床症状隐匿，当出现自身可察觉的不适时疾病多已进入中晚期；此外肝癌病情进展迅速，肿瘤易发生转移，因而患者常常错过最佳治疗时机。尽管目前医学发展迅速，肝癌的临床筛查、预防和治疗等方面也取得极大进步，但全世界范围内肝癌患者的发病率(居恶性肿瘤第六位)和死亡率(居癌症所致死亡率的第四位)居高不下，中国更是肝癌的高发国家，全世界大约50%的新发肝癌患者发生在我国，因此寻找能够预防和治疗肝癌的新方式刻不容缓。
近年来多项研究证实，肿瘤不仅是一种基因病，也是一种能量代谢性疾病。癌细胞为了满足自身快速分裂增殖的物质需求，即使在细胞氧供应充足的情况下，也主要通过糖酵解获取能量，即“Warburg效应”，此效应也被当作癌症的典型特点之一被广泛认可。肿瘤细胞的有氧糖酵解会促进肿瘤细胞对葡萄糖的摄取，增加乳酸的分泌，从而制造更加有利于肿瘤细胞生长的微环境。因而靶向肿瘤细胞有氧糖酵解，抑制肿瘤细胞的瓦勃效应，成为近来探索肿瘤发生发展的机制、寻找肿瘤治疗方式的新策略。
二甲双胍是世界卫生组织批准的仅有的两种糖尿病口服药物之一，因其安全性高、副作用小、经济实惠、病人耐受性好等特点被临床医师及众多糖尿病患者普遍认可。2005年一份流行病学报告指出，二甲双胍能够降低2型糖尿病患者的癌症发病率，此后大量的临床调查和科研实验陆续开展，旨在探讨和验证二甲双胍的抗癌机制和效果。
本课题组前期研究也发现，二甲双胍可通过调控HIF-1α、p53、AMPK等信号通路对肝癌产生抑制作用；并且也有研究发现糖代谢调控酶PFKFB3受到阿司匹林、索拉菲尼等的影响从而发挥抗肝癌的作用，然而二甲双胍对糖代谢限速酶PFK1的作用及调控机制并不清楚。
为此，本研究拟从肝癌细胞、肝癌裸鼠移植瘤模型等方面，探讨二甲双胍对体内外肝癌模型的干预作用，及药物对肝癌糖代谢重编程的调控，为寻找二甲双胍抗肝癌治疗的新靶点和分子机制提供理论依据。
研究方法：
(1)细胞增殖试验培养肝癌细胞Huh7和HepG2，待细胞状态生长良好时，做以下处理：对照组(Met:0 mM)和处理组(Met:1 mM，2 mM，5 mM)，然后采用MTS方法和实时细胞分析(RTCA)方法检测细胞的增殖情况。
(2)GC-MS和LC-MS检测选用对数生长期的肝癌细胞株Huh7，将其均匀接种至6孔板中，培养24h后用二甲双胍(2 mM)处理细胞24h，按照实验要求制备代谢流样品，将其衍生化后收集样品，上机检测，分析二甲双胍处理组与对照组间的各物质差异。
(3)Westernblot实验将生长状态良好的Huh7和HepG2均匀接种至6孔板中，待细胞贴壁牢固后分别用二甲双胍(2 mM)、复合物C(CC)和二氯化钴(CoCl2)处理细胞，常规培养24小后收集细胞，提取蛋白；采用Westernblot检测HIF-1α、AMPK、p-AMPK、PFKFB3、PFK1等蛋白的表达变化。
(4)PFK1活性检测用二甲双胍(0 mM，1 mM，2 mM)处理Huh7和HepG2两种细胞株24h后，收集细胞提取总蛋白；用PFK1活性检测体系检测二甲双胍对肝癌细胞PFK1活性的影响。
实验结果：
(1)二甲双胍抑制肝癌细胞增殖与对照组相比，二甲双胍明显抑制肝癌细胞的增殖，且具有浓度依赖性和时间依赖性。
(2)二甲双胍抑制肝癌细胞糖酵解流量经GC-MS和LC-MS两种方法检测发现，与对照组相比，二甲双胍显著抑制丙酮酸、乳酸、果糖-6-磷酸，2/3-磷酸甘油酸，磷酸烯醇式丙酮酸等多种糖酵解代谢产物的含量。
(3)肝癌细胞中多种糖酵解代谢酶受到二甲双胍的抑制Westernblot检测结果表明，与对照组相比，二甲双胍处理组中糖酵解调控酶PFKFB3、PFK1蛋白表达均下降，且关键酶PFK1的活性也受到抑制，但AMPK抑制剂CC并未影响二甲双胍对PFKFB3和PFK1的调控作用；此外，在CoCl2诱导的缺氧环境中，二甲双胍可改善缺氧环境(降低HIF-1α的蛋白水平)，抑制PFKFB3、PFK1的蛋白水平。。
实验结论：
(1)二甲双胍在体外抑制肝癌细胞株Huh7和HepG2的生长，并且存在剂量和时间依赖性。
(2)二甲双胍在肝癌细胞株中能通过调控HIF-1α/PFKFB3/PFK1通路减弱糖酵解。
原发性肝癌是一种全球范围内常见的恶性肿瘤，其中75%-85%的肝癌为肝细胞癌(HCC)。人体肝脏的代偿功能很强大，早期肝癌患者的临床症状隐匿，当出现自身可察觉的不适时疾病多已进入中晚期；此外肝癌病情进展迅速，肿瘤易发生转移，因而患者常常错过最佳治疗时机。尽管目前医学发展迅速，肝癌的临床筛查、预防和治疗等方面也取得极大进步，但全世界范围内肝癌患者的发病率(居恶性肿瘤第六位)和死亡率(居癌症所致死亡率的第四位)居高不下，中国更是肝癌的高发国家，全世界大约50%的新发肝癌患者发生在我国，因此寻找能够预防和治疗肝癌的新方式刻不容缓。
近年来多项研究证实，肿瘤不仅是一种基因病，也是一种能量代谢性疾病。癌细胞为了满足自身快速分裂增殖的物质需求，即使在细胞氧供应充足的情况下，也主要通过糖酵解获取能量，即“Warburg效应”，此效应也被当作癌症的典型特点之一被广泛认可。肿瘤细胞的有氧糖酵解会促进肿瘤细胞对葡萄糖的摄取，增加乳酸的分泌，从而制造更加有利于肿瘤细胞生长的微环境。因而靶向肿瘤细胞有氧糖酵解，抑制肿瘤细胞的瓦勃效应，成为近来探索肿瘤发生发展的机制、寻找肿瘤治疗方式的新策略。
二甲双胍是世界卫生组织批准的仅有的两种糖尿病口服药物之一，因其安全性高、副作用小、经济实惠、病人耐受性好等特点被临床医师及众多糖尿病患者普遍认可。2005年一份流行病学报告指出，二甲双胍能够降低2型糖尿病患者的癌症发病率，此后大量的临床调查和科研实验陆续开展，旨在探讨和验证二甲双胍的抗癌机制和效果。
本课题组前期研究也发现，二甲双胍可通过调控HIF-1α、p53、AMPK等信号通路对肝癌产生抑制作用；并且也有研究发现糖代谢调控酶PFKFB3受到阿司匹林、索拉菲尼等的影响从而发挥抗肝癌的作用，然而二甲双胍对糖代谢限速酶PFK1的作用及调控机制并不清楚。
为此，本研究拟从肝癌细胞、肝癌裸鼠移植瘤模型等方面，探讨二甲双胍对体内外肝癌模型的干预作用，及药物对肝癌糖代谢重编程的调控，为寻找二甲双胍抗肝癌治疗的新靶点和分子机制提供理论依据。
研究方法：
(1)细胞增殖试验培养肝癌细胞Huh7和HepG2，待细胞状态生长良好时，做以下处理：对照组(Met:0 mM)和处理组(Met:1 mM，2 mM，5 mM)，然后采用MTS方法和实时细胞分析(RTCA)方法检测细胞的增殖情况。
(2)GC-MS和LC-MS检测选用对数生长期的肝癌细胞株Huh7，将其均匀接种至6孔板中，培养24h后用二甲双胍(2 mM)处理细胞24h，按照实验要求制备代谢流样品，将其衍生化后收集样品，上机检测，分析二甲双胍处理组与对照组间的各物质差异。
(3)Westernblot实验将生长状态良好的Huh7和HepG2均匀接种至6孔板中，待细胞贴壁牢固后分别用二甲双胍(2 mM)、复合物C(CC)和二氯化钴(CoCl2)处理细胞，常规培养24小后收集细胞，提取蛋白；采用Westernblot检测HIF-1α、AMPK、p-AMPK、PFKFB3、PFK1等蛋白的表达变化。
(4)PFK1活性检测用二甲双胍(0 mM，1 mM，2 mM)处理Huh7和HepG2两种细胞株24h后，收集细胞提取总蛋白；用PFK1活性检测体系检测二甲双胍对肝癌细胞PFK1活性的影响。
实验结果：
(1)二甲双胍抑制肝癌细胞增殖与对照组相比，二甲双胍明显抑制肝癌细胞的增殖，且具有浓度依赖性和时间依赖性。
(2)二甲双胍抑制肝癌细胞糖酵解流量经GC-MS和LC-MS两种方法检测发现，与对照组相比，二甲双胍显著抑制丙酮酸、乳酸、果糖-6-磷酸，2/3-磷酸甘油酸，磷酸烯醇式丙酮酸等多种糖酵解代谢产物的含量。
(3)肝癌细胞中多种糖酵解代谢酶受到二甲双胍的抑制Westernblot检测结果表明，与对照组相比，二甲双胍处理组中糖酵解调控酶PFKFB3、PFK1蛋白表达均下降，且关键酶PFK1的活性也受到抑制，但AMPK抑制剂CC并未影响二甲双胍对PFKFB3和PFK1的调控作用；此外，在CoCl2诱导的缺氧环境中，二甲双胍可改善缺氧环境(降低HIF-1α的蛋白水平)，抑制PFKFB3、PFK1的蛋白水平。。
实验结论：
(1)二甲双胍在体外抑制肝癌细胞株Huh7和HepG2的生长，并且存在剂量和时间依赖性。
(2)二甲双胍在肝癌细胞株中能通过调控HIF-1α/PFKFB3/PFK1通路减弱糖酵解。