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第一部分表没食子儿茶素没食子酸酯对人膀胱癌T24细胞增殖的影响目的研究表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatcchin gallate，EGCG，绿茶的一种主要成分)在体外对人膀胱癌细胞系T24细胞增殖和细胞周期的影响及其可能机制。方法采用MTT法观察不同浓度的EGCG(10，20，40，和80μg/mL)作用不同时间(12，24，36，和48h)后对T24细胞增殖的影响。同时应用集落形成试验观察不同浓度的EGCG(1，5，10，20和40μg/mL)对T24细胞集落形成的影响。收获不同浓度EGCG(10，20，40，和80μg/mL)作用24小时的T24细胞，碘化丙锭(PI)染色后经流式细胞仪检测，并对获取数据进行细胞周期分析。应用Western blotting方法检测与细胞周期调节相关蛋白Cyclin D1和CDK4的表达，以观察EGCG作用对其影响。结果1．EGCG能显著抑制T24细胞增殖，并随药物浓度升高(10-80μg/mL)和作用时间的延长(12-48h)而抑制作用增强，呈明显浓度和时间依赖性。2．在EGCG(20-100μg/mL的浓度)作用12h后，T24细胞增殖抑制率范围为1％-26％，而在作用24，36，和48h后，其抑制率分别为4％-61％，9％-83％和10％-91％。3．EGCG能抑制T24细胞集落形成，在浓度大于10μg/mL尤其明显，在最大两个浓度组(20和40μg/mL)完全抑制其细胞集落形成，在集落形成试验结束时未见到有细胞集落形成。4．经流式细胞仪检测，不同浓度EGCG(10，20，40，和80μg/mL)作用24小时能明显使T24细胞在G0/G1期细胞增多，出现G0/G1期阻滞，呈剂量依赖性。5．EGCG(10，20，40，和80μg/mL)作用24小时后，随着作用浓度的增加，T24细胞Cyclin D1和CDK4的表达逐渐降低，呈显著的浓度依赖性。结论EGCG能显著抑制T24细胞增殖和集落形成，其抑制作用呈时间和剂量依赖性。EGCG能显著抑制T24细胞中Cyclin D1和CDK4的表达，其可能是诱导T24细胞G0/G1期阻滞的分子机制之一。第二部分表没食子儿茶素没食子酸酯对人膀胱癌T24细胞凋亡的影响目的研究EGCG在体外对人膀胱癌细胞系T24细胞凋亡的诱导作用，并探讨其诱导凋亡的相关信号通路等分子机制。方法研究EGCG对T24细胞增殖的抑制作用是否为诱导细胞凋亡的结果。用光学显微镜及荧光染色观察经EGCG作用后T24细胞具有的凋亡形态学改变。采用流式细胞仪(PI和annexin V双染法)检测细胞凋亡率的变化。采用Western blotting方法检测不同浓度EGCG(10，20，40，和80μg/mL)作用24小时后T24细胞中PI3K/Akt和MAPK(Erk)两条信号通路的改变。同时研究了caspase-3，PARP，Bcl-2家族等蛋白在诱导细胞凋亡中的作用。结果1．不同浓度EGCG(10，20，40，和80μg/mL)作用于T24细胞24小时后能明显诱导细胞凋亡，凋亡的诱导作用呈显著剂量依赖性。2．光学显微镜显示不同浓度EGCG(10，20，40，和80μg/mL)作用于T24细胞24小时后使细胞密度呈剂量依赖性降低。同时观察到凋亡细胞所具有的典型形态学改变。3．通过流式细胞仪(PI和annexin V双染法)检测发现EGCG作用于T24细胞24小时后细胞凋亡呈剂量依赖性增加。EGCG(10-80μg/mL)作用24小时后产生的早期凋亡细胞分别为0.7％-13.1％，晚期凋亡细胞分别为0.9％-26.0％，总的凋亡细胞为0.8％-39.1％。4．EGCG(10-80μg/mL)作用24小时后，随着作用浓度的增加，T24细胞caspase-3和PARP均被激活，呈显著的浓度依赖性，表现为procaspase-3的减少和裂解的PARP片段(89KD)出现。5．EGCG(10-80μg/mL)作用24小时后，随着作用浓度的增加，T24细胞phospho-PDK1，phospho-Thr308-Akt，和phospho-Ser473-Akt的表达逐渐降低，呈显著的浓度依赖性，但t-Akt未见改变。6．EGCG(10-80μg/mL)作用24小时后，随着作用浓度的增加，T24细胞pErk1/2的表达逐渐增高，呈显著的浓度依赖性。7．EGCG(10-80μg/mL)作用24小时后，随着作用浓度的增加，T24细胞的Bax表达逐渐增高，Bcl-2的表达逐渐降低，呈显著的浓度依赖性。8．EGCG(10-80μg/mL)作用24小时后，随着作用浓度的增加，T24细胞中Bax/Bcl-2的比例逐渐增高，呈显著的浓度依赖性。9．EGCG(10-80μg/mL)作用24小时后，随着作用浓度的增加，T24细胞的Bad表达逐渐增高，Bcl-xL的表达逐渐降低，呈显著的浓度依赖性。结论EGCG能诱导T24细胞凋亡，凋亡的诱导作用呈显著剂量依赖性。EGCG能显著抑制T24细胞PI3K/Akt信号通路的激活从而调节Bcl-2家族等蛋白并最终诱导凋亡发生。第三部分表没食子儿茶素没食子酸酯对人膀胱癌T24细胞侵袭转移的影响目的研究EGCG在体外对人膀胱癌细胞系T24细胞侵袭转移能力的影响及其可能机制。方法MTT法检测EGCG对T24细胞粘附纤维连接蛋白(fibronectin)能力的影响，Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭实验检测EGCG对T24细胞侵袭能力的影响，划痕愈合试验检测EGCG对T24细胞迁移能力的影响。采用RT-PCR方法检测EGCG(10，20，40，和80μg/mL)作用24小时后的T24细胞中MMP-9mRNA和MMP-2 mRNA的表达。采用Western blotting方法检测EGCG(10，20，40，和80μg/mL)作用24小时后的T24细胞中MMP-9蛋白的表达。结果1．EGCG(10-80μg/mL)作用24小时后，随着作用浓度的增加，T24细胞粘附纤维连接蛋白能力逐渐降低，呈显著的浓度依赖性。2．EGCG(10-80μg/mL)作用不同时间(0，6，12和24小时)后，T24细胞的迁移能力逐渐降低，呈显著的浓度和时间依赖性。3．体外的侵袭试验显示EGCG(10-80μg/mL)作用24小时后，随着作用浓度的增加，T24细胞侵袭能力逐渐降低，呈显著的浓度依赖性。4．EGCG(10-80μg/mL)作用24小时后，随着作用浓度的增加，T24细胞的MMP-9mRNA表达逐渐降低，呈显著的浓度依赖性。5．EGCG(10-80μg/mL)作用24小时后，随着作用浓度的增加，T24细胞的MMP-9蛋白表达逐渐降低，呈显著的浓度依赖性。结论EGCG能显著抑制T24细胞的粘附、迁移和侵袭能力。EGCG这种侵袭转移抑制能力可能与降低MMP-9的表达有关。