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酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵是葡萄酒酿造的两个重要生化过程,通常由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和酒酒球菌(Oenococcus oeni)完成。苹果酸-乳酸酶基因(mleA)和苹果酸通透酶基因(mleP)是O. oeni 进行苹果酸-乳酸发酵(MLF)的两个关键基因。为了避免乳酸菌在发酵过程中产生不必要或不安全次生代谢物质,减少细菌引发葡萄酒微生物破败的危害,经济有效地控制葡萄酒发酵,缩短葡萄酒酿造周期,本项目利用前期研究筛选出的酒酒球菌优良菌系,克隆其mleA 基因和mleP 基因并转化S.cerevisiae,进行它们在S.cerevisiae 中的转化、表达、相互作用及共表达研究,得出的主要结论如下: 1. 酒酒球菌mleA 基因的克隆及其在酿酒酵母中的转化与表达苹果酸-乳酸酶是进行MLF 的功能酶。本研究利用西北农林科技大学葡萄酒学院首次在国内筛选出的酒酒球菌优良菌系Oenococcus oeni SD-2a,进行其苹果酸-乳酸酶基因mleA 的克隆及其在S.cerevisiae 中的转化与表达研究: (1)构建了O.oeni SD-2a苹果酸-乳酸酶基因的重组质粒pLmleA并测序(GenBank登录的序列号为AY786176);测序分析表明克隆到的基因序列与GenBank 已报导序列(序列号X82326)同源性为99%,有两个碱基发生变化,其中一个为错义突变,编码的氨基酸由Asp 变为Glu,并缺少了BamHI 位点; (2)以PGK1 强启动子和ADH1 终止子为调控元件,以大肠杆菌-酵母菌附加体型穿梭质粒YEp352 及整合型质粒YIp5 为载体,构建了包含mleA 基因的重组表达质粒pYELmleA、pYELmleAP 和pYILmleA; (3)用重组表达质粒pYELmleA、pYELmleAP 及pYILmleA转化酿酒酵母YS58,用SD/-Ura 培养基平板筛选鉴定,得到了相应的酵母转化子YS58/pYELmleA、YS58/ pYELmleAP 和YS58/pYILmleA;