【摘 要】
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背景 先前研究已证明细胞自噬、凋亡及内质网应激共同参与肝细胞癌的发生、发展。索拉非尼作为晚期肝细胞癌患者的治疗用药,研究发现索拉非尼调节细胞自噬、凋亡与肝细胞癌不同非折叠蛋白反应信号通路相关。本研究旨在探讨PERK酶活性在索拉非尼诱导肝细胞癌自噬、凋亡中的影响及机制研究。方法 1.通过sgRNA-PERK慢病毒构建靶向干扰PERK的HepG2稳转细胞株,通过qRT-PCR、免疫蛋白印迹验证PERK
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背景 先前研究已证明细胞自噬、凋亡及内质网应激共同参与肝细胞癌的发生、发展。索拉非尼作为晚期肝细胞癌患者的治疗用药,研究发现索拉非尼调节细胞自噬、凋亡与肝细胞癌不同非折叠蛋白反应信号通路相关。本研究旨在探讨PERK酶活性在索拉非尼诱导肝细胞癌自噬、凋亡中的影响及机制研究。方法 1.通过sgRNA-PERK慢病毒构建靶向干扰PERK的HepG2稳转细胞株,通过qRT-PCR、免疫蛋白印迹验证PERK表达。2.台盼蓝染色探索敲减PERK联合索拉非尼以及在毒胡萝卜素作用下索拉非尼对细胞杀伤作用的影响。3.通过qRT-PCR检测PERK mRNA、CHOP mRNA水平,免疫蛋白印迹检测PERK、caspase3、P62蛋白表达水平以及流式细胞学检测细胞凋亡率。结果 1.成功构建PERK敲减的sgRNA-PERK HepG2细胞及阴性对照的NC HepG2细胞,经验证PERK敲减率最高可达89.4%。2.台盼蓝结果提示敲减PERK可减弱索拉非尼对肝癌HepG2细胞的杀伤作用,Tg诱导的内质网应激下索拉非尼的杀伤作用减弱更为显著;流式细胞学检测细胞凋亡亦证实此结果。3.qRT-PCR结果示索拉非尼可诱导CHOP表达,敲减PERK可减少CHOP表达,且在内质网应激下CHOP表达减少更加明显。4.免疫蛋白印迹结果显示:敲减PERK可减少索拉非尼对凋亡蛋白caspase3的剪切作用,在内质网应激下caspase3剪切作用明显减少,即细胞凋亡减少;同时发现敲减PERK可抑制自噬底物P62的降解,即抑制细胞自噬,在Tg诱导的内质网应激下自噬抑制更加明显。结论 索拉非尼可通过PERK/CHOP信号通路促进肝癌细胞凋亡,且PERK可诱导肝癌细胞自噬性细胞死亡,从而增加肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。
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