柠檬酸(C6H8O7)是最重要的有机酸之一,被公认为安全的产品,在食品、化工、制药、纺织业等行业都有广泛应用。目前,大部分柠檬酸发酵都是利用黑曲霉完成。在黑曲霉的柠檬酸发酵过程中,草酰乙酸和乙酰CoA在柠檬酸合酶的作用下合成柠檬酸。草酰乙酸对于柠檬酸的合成起到了关键作用,其中本文所涉及到的苹果酸酶、丙酮酸羧化酶、草酰乙酸转运蛋白都直接或间接地参与了草酰乙酸的合成。因此,本论文主要以草酰乙酸的代谢为切入点,通过敲除NAD+-苹果酸酶(malic enzyme)、丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)、草酰乙酸转运蛋白(oxaloacetate transport protein)编码基因来研究草酰乙酸对黑曲霉产柠檬酸的影响。本文选用p44载体作为基因敲除质粒。首先通过PCR扩增出目的片段,在T4DNA连接酶的作用下,上下游片段依次被连接到p44载体的T-DNA区中,并在大肠杆菌中得到扩增以得到敲除载体p44-me, p44-mpyc, p44-oat。之后通过电转化方法,将这3个敲除载体转到根癌农杆菌中。再通过根癌农杆菌介导的A.niger转化技术,使得携带有同源臂的T-DNA单链线性片段进入到A.niger的细胞内,得到的转化子通过PCR的方法验证,在通过同源重组后实现目的基因的成功敲除。得到的基因敲除菌株分别为NAD+-ME△(苹果酸酶基因敲除菌株)、mPYC△(线粒体丙酮酸羧化酶基因敲除菌株)、OAT△(草酰乙酸转运蛋白基因敲除菌株)。本文通过对突变株与野生株进行多次发酵实验并通过HPLC来进行分析,结果表明三个突变株与野生株在以140g/L的蔗糖为碳源时,发酵9天后得到的菌体量均在15g/L左右,剩余的残糖量也维持在25g/L左右。另外三个突变株的柠檬酸产量较野生株都有减少。野生株为75g/L; NAD+-ME△为65g/L; mPYC△为61g/L; OAT△为68g/L。其中mpyc基因的敲除对于柠檬酸代谢的影响最大,与野生菌相比较,mPYC△降低了约18.67%；其次是NAD+-ME△,大约降低了13.33%;影响最小的是OAT△,大约降低了9.33%。