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本实验旨在从分子水平和细胞水平上探究FSTL3在绵羊常年发情中的功能,来揭示FSTL3与绵羊繁殖季节性间的关系,为进一步阐明绵羊常年发情的分子机理提供理论基础。通过验证不同生理状态下小尾寒羊和滩羊卵巢中FSTL3基因的表达差异情况,以常年发情的小尾寒羊卵巢颗粒细胞为研究对象,建立稳定的绵羊卵巢颗粒细胞的原代培养体系,在细胞水平上对FSTL3基因进行RNA干扰,利用Real-time PCR、Western-Blot以及免疫荧光技术分别在RNA水平和蛋白水平上验证FSTL3蛋白表达的抑制情况,并通过放射性免疫分析检测FSTL3基因被干扰后颗粒细胞中雌二醇与孕酮浓度的变化,实验结论如下：1.通过RT-PCR检测处于不同生理状态下的小尾寒羊和滩羊卵巢组织中FSTL3基因的表达量,发现在两种绵羊的卵巢组织中,FSTL3基因的表达水平均随着发情周期呈波动性表达：FSTL3基因的表达水平在发情间期达到顶峰,随着发情周期逐渐下降,并在发情期降至最低。在秋季,小尾寒羊和滩羊发情期的FSTL3基因表达量没有差异。在春季时,滩羊处于乏情期,FSTL3基因的表达相对稳定,保持在一个较低的水平；而小尾寒羊FSTL3基因的表达水平依然成周期性变化,为了探究FSTL3基因是否影响小尾寒羊的常年发情启动,我们在细胞水平上进一步研究。2.对原代培养的卵巢颗粒细胞进行FSHR免疫荧光染色,结果显示原代培养的卵巢颗粒细胞纯度高,FSHR阳性率达95%以上,可以直接进行后续实验。3.用RNAi的方法对小尾寒羊卵巢颗粒细胞中FSTL3基因表达进行抑制,通过RT-PCR发现FSTL3基因的3条siRNA的干扰效率分别为62.33%、49.27%、85.84%,其中SiRNA-3能有效地干扰卵巢颗粒细胞中FSTL3基因的表达。4.在蛋白水平上验证RNAi的作用,Western-blot和细胞免疫荧光染色的结果表明,FSTL3干扰组的蛋白表达量极显著降低(P<0.01),说明FSTL3蛋白被有效抑制。5.对RNAi后48h的细胞培养基进行放射性免疫分析,结果显示FSTL3基因的表达被抑制后,细胞培养基中的E2含量显著增加(P<0.05),P4的含量极显著减少(P<0.01),证实FSTL3基因对颗粒细胞分泌E2有一定负调控作用,对P4有正调控作用,进一步表明FSTL3基因可能对绵羊的季节性繁殖有一定调控作用。