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对于恶性肿瘤,人们不断探索、不断创新,寻求更加有效的治疗方案,随着科学技术的不断发展,肿瘤免疫疗法应运而生,通过调节肿瘤微环境,增强机体抗肿瘤免疫效应,最终控制肿瘤进展甚至消除肿瘤。肿瘤微环境是由基质细胞(成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等)、细胞外基质(ECM)以及一系列可溶性因子组成。肿瘤细胞与肿瘤微环境相互作用,最终导致肿瘤的发生和发展。骨髓源性抑制细胞(MDSCs)、调节性T细胞(Tregs)等则是肿瘤微环境中直接参与促进肿瘤进展的重要免疫抑制性细胞。肿瘤免疫疗法包括免疫检查点抗体阻断疗法、肿瘤疫苗、过继性细胞治疗等,其中,免疫检查点阻断疗法通过阻断以CTLA-4和PD-1作为典型代表的负性免疫检查点分子与其相应配体的结合,从而恢复T细胞免疫活性,恢复机体的免疫监视,维持免疫稳态。CTLA-4主要在T淋巴细胞活化后诱导性表达,结构上与CD28分子高度同源,CTLA-4竞争性结合抗原提呈细胞上的B7配体(CD80和CD86),抑制T细胞活化信号转导。CTLA-4往往高表达于肿瘤浸润性Tregs细胞,通过抗CTLA-4 mAb(单克隆抗体)治疗,使肿瘤微环境中巨噬细胞通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)选择性清除肿瘤内Tregs细胞,同时增强CD4+Th1型细胞效应功能,最终发挥抗肿瘤作用。PD-1主要表达在活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞以及自然杀伤(NK)细胞等细胞表面,通过阻断PD-1/PD-L1(PD-1的配体)信号通路,逆转耗竭样肿瘤浸润CD8+T细胞的效应功能,从而恢复机体抗肿瘤免疫应答。已有多项临床前试验和临床试验表明,免疫检查点阻断疗法可以广泛用于多种晚期肿瘤包括黑色素瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤等的治疗,有效地抑制肿瘤生长和转移,延长患者无进展生存期。然而,免疫检查点阻断剂的反应率仍然有限,许多患者对治疗无反应或者是产生耐药性,这也提示将传统/新型治疗,如化疗、放射、表观遗传调节剂、小分子靶向治疗或其他疗法,与免疫检查点阻断疗法相结合,来增加全身抗肿瘤免疫应答,减少免疫相关的不良事件(irAE),可能是一个不错的选择。细胞因子IL-33是IL-1超家族成员,在上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞的细胞核呈组成性表达,通过与其受体ST2结合,最终在固有免疫和适应性免疫中起重要作用。研究表明,IL-33既能参与Th2型炎症免疫应答,还与Th1型抗肿瘤免疫应答密切相关。IL-33/ST2通路可以通过增加肿瘤浸润性CD8+T细胞和NK细胞的数量,以及IFN-γ和穿孔素等效应分子的分泌,从而抑制B16黑色素瘤和Lewis肺癌小鼠模型中肿瘤的生长和转移。T细胞在肿瘤微环境中的浸润和功能决定了机体肿瘤免疫应答的结果。机体内发挥抗肿瘤效应功能的一般都是终末分化的效应T细胞,难以在体内长期存活,而记忆性T细胞则对免疫记忆的长期维持和肿瘤免疫应答至关重要。在肿瘤微环境中,记忆性T细胞的浸润是评估患者预后的重要指标之一。记忆性T细胞亚群包括中央型记忆T细胞(CD44+CD62L+TCM)、效应型记忆T细胞(CD44+CD62L-TEM)以及组织原位记忆T细胞(CD103+TRM),它们有助于免疫监视,并在继发感染和/或长期感染时更好地控制持续性感染。有研究表明,肿瘤浸润CD103+CD8+T细胞数量与肺癌、卵巢癌、黑色素瘤等肿瘤患者良好的预后成显著正相关。TGF-β、TNF-α和IL-33可上调CD103在CD8+T细胞上的表达,IL-33在一定程度上促进了 CD4+Foxp3+Tregs细胞的增殖,已有研究表明,CTLA-4在调节性T细胞上组成性表达,因此,本课题旨在揭示IL-33/ST2途径在免疫检查点分子CTLA-4、PD-1抗体阻断治疗中的重要作用,建立IL-33联合免疫检查点抗体治疗的肿瘤免疫治疗新模式及其机制,以期为临床肿瘤免疫治疗提供新的思路。第一部分:细胞因子IL-33联合免疫检查点分子CTLA-4抗体阻断在治疗恶性肿瘤中的效应和机制研究[目的]在小鼠黑色素瘤荷瘤模型中,探讨细胞因子IL-33联合免疫检查点分子CTLA-4抗体阻断在治疗恶性肿瘤中的效应以及可能的机制。[方法]1、将WT小鼠随机分组,分别于腹部右侧皮下接种小鼠黑色素瘤细胞B16或B16-IL-33,2×105 cell/50μl/mouse,构建黑色素瘤小鼠模型。从接种部位出现肉眼可见肿瘤(即肿瘤细胞接种第6天)开始进行免疫检查点抗体治疗,于肿瘤接种部位的对侧腹腔注射IgG对照抗体或Anti-mouse CTLA-4 antibody 200μg/100μl/次,每4天治疗一次,共治疗4次。同时,从肿瘤接种当天起,每2天记录小鼠肿瘤大小以及小鼠生存情况,绘制肿瘤生长曲线和小鼠生存曲线。2、在肿瘤细胞接种第10天(即抗体二次治疗后当天)和第18天(即抗体四次治疗后当天),分别留取4组小鼠的肿瘤,通过Real-time PCR技术检测分析不同治疗时间点肿瘤组织中效应分子IFN-γ、TNF-α等在mRNA水平的表达情况。3、在肿瘤细胞接种第11天(即抗体二次治疗后第二天)和第19天(即抗体四次治疗后第二天),分别留取4组小鼠肿瘤,通过免疫荧光标记和流式细胞术检测分析不同治疗时间点肿瘤微环境各免疫细胞群体的浸润情况及其效应功能。[结果]1、细胞因子IL-33联合抗CTLA-4 mAb治疗显著抑制黑色素瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期,差异具有统计学意义,P<0.05;2、流式细胞术检测肿瘤微环境各免疫细胞群体的浸润,联合治疗组肿瘤微环境中CD45+细胞、CD8+T淋巴细胞浸润有所增加,CD4+T淋巴细胞浸润增加最为显著,差异具有统计学意义,P<0.05;3、DAY19,治疗组肿瘤微环境中CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ均有所增加,联合组增加最显著;4、DAY11和DAY19,免疫检查点分子单抗治疗组Foxp3+CD4+Tregs细胞有所下调,但是IL-33有上调Foxp3+CD4+Tregs细胞的趋势,差异具有统计学意义,P<0.05;同时,免疫检查点分子单抗治疗组在DAY11和DAY19,CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞中IFN-γ+效应性T细胞与Foxp3+调节性T细胞的比例(Teffs/Tregs)都有增加的趋势;5、DAY19,肿瘤微环境中Gr-1hiCD11b+MDSCs在治疗组中均有明显降低,并以联合组降低最为显著,差异具有统计学意义,P<0.05;6、IL-33增加了肿瘤微环境CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞中TCM细胞和TRM细胞的浸润,抗CTLA-4抗体阻断治疗增加了肿瘤微环境CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞中TEM细胞的浸润;7、DAY10和DAY18,Real-time PCR结果显示,与对照组相比,联合组肿瘤微环境中GZM-B、TNF-α、IL-12均上调表达,差异具有统计学意义,P<0.05;8、DAY30,接种B16-IL-33肿瘤的两组中,与对照组相比,联合组肿瘤微环境中IFN-γ、perforin、TNF-α均有上调表达;同时,联合组肿瘤微环境中CD103和CD69表达也有显著上调,差异具有统计学意义,P<0.05。[结论]细胞因子IL-33联合免疫检查点分子CTLA-4抗体阻断通过增加肿瘤微环境中免疫细胞各群体,包括CD45+细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的浸润,促进其效应分子的分泌;同时抑制肿瘤微环境中Tregs以及MDSCs等免疫抑制细胞表达;并且,上调记忆性T细胞,尤其是CD103+TRM细胞的表达,从而增强机体抗肿瘤免疫应答效应,有效抑制肿瘤生长,延缓荷瘤小鼠生存期。所获结果为细胞因子IL-33联合免疫检查点分子抗体阻断的治疗新模式提供实验基础和潜在的临床应用可能。第二部分:细胞因子IL-33联合免疫检查点分子PD-1和CTLA-4抗体阻断在治疗恶性肿瘤中的效应和机制研究本课题组前期研究证实:在Humanized PD-1 KI/KO小鼠中,细胞因子IL-33联合免疫检查点分子PD-1抗体阻断能够增强肿瘤微环境免疫细胞的浸润及效应功能,促进抗肿瘤免疫应答,从而荷瘤小鼠的肿瘤生长受到显著抑制,生存期得到显著延长。因此,本文结合前期的实验结果,将细胞因子IL-33与免疫检查点分子PD-1和CTLA-4阻断疗法相联合,观察三者是否能够进一步协同增强抗肿瘤免疫效应,为临床肿瘤免疫治疗提供相应的理论依据。[目的]在小鼠黑色素瘤荷瘤模型中,探讨细胞因子IL-33联合免疫检查点分子PD-1和CTLA-4抗体阻断在治疗恶性肿瘤中的效应以及可能的机制。[方法]1、将Humanized PD-1 KI/KO小鼠随机分组,分别于腹部右侧皮下接种小鼠黑色素瘤细胞B16或B16-IL-33,2×105cell/50μl/mouse,构建黑色素瘤小鼠模型。从接种部位出现肉眼可见肿瘤(即肿瘤细胞接种第6天)起开始进行抗体治疗,即于肿瘤接种部位的对侧腹腔分别注射PBS(为了避免IgG抗体的干扰)、Humanized anti-PD-1 mAb、Anti-mouse CTLA-4 antibody 以及 Humanized anti-PD-1 mAb+Anti-mouse CTLA-4antibody,200μg/100μl/次,每4天治疗一次,共治疗4次。同时,自肿瘤接种当日起,每2天记录小鼠肿瘤生长和生存情况,绘制肿瘤生长曲线和小鼠生存曲线。2、在肿瘤细胞接种第10天(即抗体二次治疗后当天)和第18天(即抗体四次治疗后当天),分别留取8组小鼠的肿瘤,通过Real-time PCR技术检测分析不同治疗时间点肿瘤组织中效应分子等在mRNA水平的表达情况。3、在肿瘤细胞接种第11天(即抗体二次治疗后第二天)和第19天(即抗体四次治疗后第二天),分别留取8组小鼠肿瘤组织,通过免疫荧光标记和流式细胞术检测分析不同治疗时间点肿瘤微环境各免疫细胞群体的浸润情况及其效应功能。[结果]1、细胞因子IL-33联合免疫检查点分子PD-1和CTLA-4抗体阻断的三联组合治疗组显著抑制黑色素瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期,差异具有统计学意义,P<0.05;2、流式细胞术检测肿瘤微环境各免疫细胞群体的浸润,三联组合治疗组在肿瘤微环境中显著增加CD45+细胞、CD4+T淋巴细胞的浸润,差异具有统计学意义,P<0.05;CD8+T淋巴细胞浸润亦有增加的趋势;3、在肿瘤微环境中,IL-33增加了 CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞中TcM细胞和TRM细胞的浸润,免疫检查点抗体阻断治疗增加了 CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞中TEM细胞的浸润;4、Real-time PCR结果显示,DAY10和DAY18,三联组合治疗组肿瘤微环境中CD103和CD69显著上调表达,差异具有统计学意义,P<0.05。[结论]细胞因子IL-33与免疫检查点分子PD-1和CTLA-4抗体阻断三者联合治疗可以通过进一步增加肿瘤微环境中免疫细胞各群体,包括CD45+细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的浸润;同时,进一步上调TRM细胞的表达,从而持续性增强机体抗肿瘤免疫应答效应,最大限度地抑制肿瘤生长、延缓荷瘤小鼠生存期。