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WU多瘤病毒(WU polyomavirus,WUPyV)是新近从呼吸道分泌物中发现的多瘤病毒,目前其临床意义上不明确。为了解WUPyV在深圳和汕头地区的感染情况,以及WUPyV的分子生物学特征,为该病毒的致病性、诊断等研究提供科学依据。本论文建立了WUVyV的筛查技术,对WUPyV基因进行了克隆及核酸序列测定,在此基础上原核表达了结构蛋白VP1、VP2、VP3和非结构蛋白STAg(Small TumorAntigen),并进行了初步抗原性分析。
收集2006年6月-2009年6月在深圳和汕头地区采集的1509份呼吸道急性感染住院儿童咽拭子分泌物。经核酸检测,其中17例(17/1.509,1.1％)为WUPyV核酸阳性,均为4岁以下患儿,男女比例11:6。17例WUPyV阳性病人的主要临床症状表现为咳嗽、发热、喘息等典型的呼吸道感染症状。临床诊断为支气管肺炎(10例)、喘肺(3例)、毛细支气管炎(2例),上呼吸道感染(1例),疱疹性咽峡炎(1例)。所有WUPyV阳性病例中与其他病毒合并感染的有7例,其中RSV(4例),IVA(1例),RHV(1例),ADV(1例),共同感染率为41%。
根据参考文献及GenBank中已知的全基因序列设计5对引物,以WUPyV阳性病例的总核酸为模板,PCR分段扩增出WUPyV的C1、C2、C3、C4和C55个片段,将它们分别连入具有氨苄青霉素抗性基因的pBM-T Easy载体,转化大肠杆菌TOP10,经筛选培养基培养,提取质粒,PCR鉴定之后,测序,通过GenBank及Blast比对,拼接,获得WUPyV的全基因序列,并提交至GenBank(accession numbers:GQ926975-GQ926980)。将获得的6株WUPyV全基因序列(基因全长3例为5228nt,3例为5229nt)与NCBI已经公布的国内外全基因序列进行核酸序列比较分析发现,毒株之间基因同源性均在98%以上,为高度保守病毒,基因突变在0%-1.5%,突变位点主要发生在非编码区和VP1编码区,而VP2和STAg编码区的突变相对较少。
根据WUPyV全基因序列的测序结果,设计引物,以WUPyV阳性病例的总核酸为模板,扩增出VP1、VP2、VP3及STAg的全基因片段,经限制性内切酶BamH I和Xbal消化后,连入融合表达载体PGEX-20T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达了氨基端融合GST的目的蛋白。Labworks蛋白分析软件分析结果表明,表达产物的分子量分别为69520、63090、56158和49000,与理论值相符。SDS-PAGE后切下目的条带,用水将凝胶内的目的蛋白浸出,然后进行血清免疫印迹,结果显示所表达的融合蛋白能识别抗VP1、VP2、VP3的抗体,表明所表达的蛋白具有抗原性。为进一步研究WUPyV的检测和致病性研究奠定了良好基础。