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帕金森病成为困扰许多中老年人的常见病,目前还没有一个有效的方法能阻止本病的进展。近年来,随着对该病研究的进一步深入,最终治疗将寄希望于新技术的成熟,如基因治疗和干细胞治疗。尤其,多项研究发现帕金森病与NF-κB的过度表达有关。2008年Torres等在Nat Cell Biol.发表论著,发现Nanog基因可抑制NF-κB的表达。为充分应用这一发现,本课题组已经通过限制性内切酶酶切和基因重组的方法,成功构建携带Nanog基因的重组慢病毒表达载体质粒PNL-Nanog-IRES2-EGFP。本研究继续构建携带小鼠Nanog基因的慢病毒载体并感染小鼠骨髓间质干细胞,观察过表达的Nanog对NF-κB表达的影响,为神经变性疾病的治疗提供新思路。本课题分三部分。第一部分:过表达Nanog基因的骨髓间质干细胞的构建、培养与鉴定1、方法:(1)将三质粒PNL-Nanog-IRES2-EGFP或PNL-IRES2-EGFP、pHELPER和pVSVG共转染293T细胞,包装生产慢病毒;(2)经超速离心收集病毒颗粒,转染293T细胞,用流式细胞术测定EGFP蛋白表达率来测定慢病毒功能滴度;(3)分别用携带相应目的基因的相同滴度慢病毒感染mMSCs;(4)用RT-PCR、Western Blot和ELISA分别检测mMSCs的Nanog的mRNA、蛋白质,以及该细胞上清液中Nanog表达水平。2、结果:(1)三质粒PNL-Nanog-IRES2-EGFP或PNL-IRES2-EGFP、pHELPER和pVSVG共转染293T细胞,包装产生慢病毒。(2)未浓缩含病毒的细胞培养上清和浓缩的病毒悬液的功能滴度分别是6.5×10~4 TU/mL和6.8×10~6 TU/mL。(3)RT-PCR、Western Blot和ELISA均证实Nanog-mMSCs组的Nanog蛋白表达增多,与空载体组相比较差异性有显著意义。3、结论:成功构建过表达Nanog基因的mMSCs。第二部分:mMSCs过表达Nanog基因对NF-κB表达的影响1、方法:(1)慢病毒的包装、浓缩和感染mMSCs的方法同上,将慢病毒液加入mMSCs中,感染mMSCs,荧光显微镜观察表达情况。(2)实验分组:Nanog-mMSCs组为携带Nanog基因慢病毒感染的mMSCs组;Mock-mMSCs组(或PNL-mMSCs组)为未携带目的基因的慢病毒感染的mMSCs组;mMSCs组为未经慢病毒感染的mMSCs组。(3)检测感染后的各组mMSCs中Nanog及NF-κB的表达情况。2、结果:(1)慢病毒感染mMSCs后,荧光显微镜下观察,PNL-MSCs组和Nanog-mMSCs组均可检测到绿色荧光表达,未感染的mMSCs未见荧光表达。(2)细胞免疫荧光、RT-PCR和Western Blot检测Mock-mMSCs组及mMSCs组NF-κBp65表达量高于Nanog-mMSCs组。3、结论:在mMSCs培养的体外实验中,过表达Nanog能抑制NF-κB表达第三部分:过表达Nanog基因的mMSCs对帕金森病小鼠NF-κB表达的影响1、方法:(1)选10~12周龄,体重25~30克成年C57BL雄性褐鼠制作小鼠帕金森模型。(2)与造模型的同日开始进行单次Nanog-mMSCs、Mock-mMSCs立体定向注射到模型鼠纹状体,对照组只注射PBS。(3)取小鼠脑制作冰冻切片在荧光显微镜下观察各组的NF-κB在黑质、纹状体的表达情况,以及观察黑质多巴胺能神经元的数量。2、结果:(1)成功建立帕金森病小鼠模型。(2)小鼠脑冰冻切片观察结果显示Mock-mMSCs组及mMSCs组NF-κBp65表达量高于Nanog-mMSCs组。Nanog-mMSCs组黑质多巴胺能神经元的数量多于其他两组。3、结论:在帕金森病动物模型上,Nanog抑制NF-κB表达,可能有保护黑质多巴胺能神经元的作用。