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第一部分 Doxorubicin诱导乳鼠心肌细胞凋亡以及抗氧化剂Ebselen的保护作用 目的： 通过给予doxorubicin体外诱导乳鼠心肌细胞发生凋亡，并检测这一过程中Caspase3、PARP-1的活化，给予抗氧化剂Ebselen后是否可以抑制doxorubicin诱导的凋亡。 方法： 一、培养第四天的乳鼠心肌细胞给予不同浓度的doxorubicin作用24h，MTT法检测心肌细胞的存活率;凋亡试剂盒检测caspase3的活性；western-blot法检测Cleaved PARP-1的表达。实验分组为：1、正常组(Con)：正常培养24h；2、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L DOX组：正常细胞分别给予上述浓度DOX培养24h。 二、培养第四天的乳鼠心肌细胞预孵育Ebselen2 h,给予1μmol/L DOX作用24h，MTT法检测心肌细胞的存活率;细胞内 ROS含量检测；细胞凋亡荧光Hochest33258试剂盒进行凋亡检测；凋亡试剂盒检测caspase3的活性；western-blot法检测PARP-1、Cleaved PARP-1的表达。实验分组：1、正常组(Con)：正常培养24h；2、1μmol/L DOX组：正常细胞给予1μmol/L DOX培养24h；3、1μmol/L DOX+50μmol/L Ebselen组：预孵育50μmol/L Ebselen2h,给予1μmol/L DOX作用24h;4、给予50μmol/L Ebselen24h。结果： 1.乳鼠心肌细胞给予不同浓度的doxorubicin作用24 h后，MTT法检测心肌细胞的存活率呈现剂量依赖性，1μmol/L与5μmol/L DOX组 MTT值下降，与对照组MTT值比较均有显著差异（P<0.01）。 2.24h后检测胞浆caspase3活性,与con组相比，1μmol/L DOX组caspase3活化度为151.23±10.41％（P<0.01）;5μmol/L DOX组caspase3活化度为161.03±12.21%（P<0.01）。 3.24h后检测Cleaved PARP-1的表达。与con组相比，1μmol/L和5μmol/L DOX组Cleaved PARP-1表达明显增加（P<0.001）。 4.预孵育50μmol/L Ebselen2h,给予1μmol/L DOX。24h后，检测细胞活力。1μmol/L DOX组MTT值下降，与对照组MTT值比较有显著差异（P<0.01）；Ebselen可以显著抑制 DOX对细胞的损伤，与 DOX组比较 MTT值比较有显著差异（P<0.05）。 5.预孵育50μmol/L Ebselen2h,给予1μmol/L DOX。24h后，加入荧光探针H2DCFDA孵育30 min清洗后观察，DOX组比con组细胞内单位面积荧光强度显著增强，证实有ROS的减产生，给予Ebselen后，ROS含量减少。 6.预孵育50μmol/L Ebselen2h,给予1μmol/L DOX。24h后，Hochest33258荧光染色。con组细胞呈低蓝色，1μmol/L DOX组细胞呈高蓝色，亮度明显增高，可观察到明显的细胞核固缩，具有凋亡的显著特征，与DOX组相比，Ebselen组凋亡有所改善。 7.预孵育50μmol/L Ebselen2h,给予1μmol/L DOX24h后，检测胞浆caspase3活性。与con组相比，1μmol/L DOX组caspase3活化度为171.04±10.41%（P<0.01）;与DOX组相比，Ebselen可以显著抑制caspase3的活化125.04±6.41%，（P<0.05）。 8.预孵育50μmol/L Ebselen2h,给予1μmol/L DOX24h后，检测Cleaved PARP-1的表达。与con组相比，1μmol/L DOX组Cleaved PARP-1表达明显增加（P<0.001）;与DOX组相比，Ebselen组Cleaved PARP-1表达明显减少（P<0.01）。 结论： 给予 DOX作用乳鼠心肌细胞，细胞的存活率呈现剂量依赖性；细胞内 ROS含量显著增加；形态学观察到显著的凋亡特征；Caspase3活性显著升高；PARP-1蛋白的剪切片段表达较正常组显著增加，给予抗氧化剂Ebselen后，与DOX组相比，凋亡得到了改善。 第二部分 Doxorubicin诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的机制研究 目的： 检测DOX诱导心肌细胞凋亡过程中Trx-ASK1是否发生了分离；以及发生分离后ASK1是否发生了活化，并进而启动ASK1介导的凋亡信号通路。 方法： 一、培养第四天的乳鼠心肌细胞预孵育Ebselen2h,给予1μmol/L DOX作用24h,免疫沉淀法检测Trx-ASK1的结合率。实验分组为：1、正常组(Con)：正常培养24h；2、1μmol/L DOX组：正常细胞给予1μmol/L DOX培养24h；3、1μmol/L DOX+50μmol/L Ebselen组：预孵育50μmol/L Ebselen2h,给予1μmol/L DOX作用24h;4、给予50μmol/L Ebselen24h。 二、培养第四天的乳鼠心肌细胞预孵育Ebselen2h,给予1μmol/L DOX作用24h，western-blot法检测p-ASK1、p-p38、p38的表达。。实验分组：1、正常组(Con)：正常培养24h；2、1μmol/L DOX组：正常细胞给予1μmol/L DOX培养24h；3、1μmol/L DOX+50μmol/L Ebselen组：预孵育50μmol/L Ebselen2h,给予1μmol/L DOX作用24h;4、给予50μmol/L Ebselen24h。 结果： 1.心肌细胞给予1μmol/L DOX作用后，与正常组比较Trx-ASK1发生了显著的分离（P<0.001）；与1μmol/L DOX组相比，1μmol/L DOX+50μmol/L Ebselen组Trx-ASK1分离显著减少（P<0.05）。 2.心肌细胞给予1μmol/L DOX作用后，与正常组比较p-ASK1ser967的表达显著减少(P<0.01），与 DOX组相比，1μmol/L DOX+50μmol/L Ebselen组p-ASK1ser967表达显著增加（P<0.01）。 3.心肌细胞给予1μmol/L DOX作用后，与正常组比较 p-p38表达显著增加（P<0.001）,与DOX组相比，Ebselen组p-p38显著增加（P<0.01）;各组之间p38的表达无显著差。 结论： DOX诱导心肌细胞凋亡过程中Trx与ASK1发生了一定程度的分离，ASK1发生了活化，进而激活了促凋亡蛋白激酶p38；给予抗氧化剂Ebselen后Trx与ASK1分离减少，ASK1、P38活化均受到了抑制。