随着人们生活方式的改变，糖尿病在全世界广泛分布，做为一种基础疾病，其发病率增高，并发症常见，病程难以控制，给人们生活、学习、经济造成严重负担。经中医临床实践的检验，已发现中药控制糖尿病有可喜的疗效。复方升清降糖合剂是在中医理论指导下，经实践检验的有效降糖汤方，临床观察结果还发现对改善全身状况，提升生活质量有很大裨益。为进一步明确其作用机制，我们从保护胰岛细胞角度入手，了解其抗细胞凋亡的作用，同时探讨其对胰岛素信号通路和凋亡通路的影响，寻找其药物作用的靶点，为临床用药和糖尿病的治疗提供新思路。 目的： (1)观察升清降糖合剂(SQ)对氧化损伤胰岛β细胞模型活性的影响； (2)探讨升清降糖合剂对细胞SOD/MDA、Bcl-2/Bax、Caspase-3的影响，揭示其抗氧化和抗凋亡作用机制； (3)研究SQ对Akt磷酸化的影响，寻找SQ抗胰岛细胞凋亡和调节胰岛素的共同信号通路。 方法： (1)称取原方比例升清降糖合剂(SQ)，研末，过筛，以半仿生提取法设计提取条件，常压恒温提取，合并两次煎液，冷冻干燥，计干浸膏总量； (2)利用不同浓度和时间H2O2诱导大鼠胰岛细胞瘤株(RINm5F)损伤，MTT检测细胞增殖率，以达到IC50做为氧化损伤凋亡模型条件，AO/PI荧光染色观察模型形态学改变，确定凋亡模型的成功； (3)以D-PBS配成不同浓度SQ，干预模型组24h后，以MTT检测细胞增殖率，倒置显微镜形态学观察，确定SQ的最佳保护剂量； (4)分模型组(H2O2)、保护组(SQ+H2O2)、正常组(D-PBS)，分别干预24 h，运用流式细胞仪检测凋亡率；光度法检测SOD/MDA、Caspase-3，免疫荧光检测Bcl-2/Bax蛋白，免疫印迹检测Akt磷酸化表达。 结果： (1)SQ的提取：以半仿生提取法提取复方有效成分，得干浸膏冻干品3.0 g。 (2)胰岛β细胞氧化损伤模型的建立：MTT法检测显示RINm5F增殖率随H2O2干预浓度的增长而减少，呈直线负相关，P<0.01，我们确定IC50即0.2 mmol·L-1H2O2干预24 h为模型条件，AO/PI形态学观察，模型组呈典型凋亡改变：细胞皱缩，核边聚，可见凋亡小泡。 (3)SQ最佳保护浓度的确立：MTT法检测不同浓度SQ加入模型组24h的细胞增殖率，其中10μg·ml-1 SQ组较模型组活性明显升高，有统计学差异(P<0.05)，倒置显微镜下观察细胞形态较模型组明显好转；而不同浓度SQ对照组(即SQ加入正常组)与正常组比较，高浓度SQ对照组(50μg·ml-1)细胞活性有所下降(P>0.05)，低浓度SQ对照组(5μg·ml-1)及中浓度SQ对照组(10μg·ml-1)对细胞活性影响不大(P>0.05)，故以10μg·ml-1 SQ组为保护治疗剂量。 (4)细胞凋亡率：流式细胞术检测凋亡率提示模型组(35.18±2.41％)增高，与正常组(17.38±0.91％)比较，差异显著(P<0.001)，与保护组(19.56±1.08％)有显著差异(P<0.01)。 (5)SOD/MDA水平： 1)细胞内：模型组SOD水平(25.36±2.94 U·ml-1)下降，与保护组(34.13±4.81U·ml-1)比较，有统计学差异(P<0.05)，模型组SOD/MDA比值(14.45±2.83)下降，与保护组(24.43±4.89)比较，有统计学差异(P<0.05)； 2)细胞外：模型组MDA水平(20.50±12.50 nmol·L-1)上升，与正常组(15.13±2.69 nmol·L-1)比较，有统计学差异(P<0.05)，与保护组(18.80±1.48 nmol·L-1)比较，有统计学差异(P<0.05)，模型组SOD/MDA比值(0.90±10.26)下降，与正常组(1.60±0.53)比较，有统计学差异(P<0.05)。 (6)Bcl-2/Bax荧光表达： Bcl-2：模型组(0.07±0.00)荧光减弱，与正常组(0.06±0.02)比较，统计学无差异(P>0.05)，与保护组(0.16±0.02)比较，统计学有差异(P<0.05)；Bax：模型组(0.09±0.01)荧光加强，与正常组(0.05±0.01)比较，统计学有差异(P<0.05)，与保护组(0.07±0.01)比较，统计学有差异(P<0.05)。 (7)Caspase-3活化程度检测： RINm5F：模型组(2.87±0.49)增强，与正常组(1.00±0.00)比较，有统计学差异(P<0.05)，与保护组(2.24±0.46)比较，无统计学差异(P>0.05)；原代胰岛：模型组(1.97±0.26)增强，与正常组(1.00±0.00)比较，有统计学差异(P<0.05)，与保护组(1.29±0.21)比较，有统计学差异(P<0.05)。 (8)磷酸化Akt蛋白表达： RINm5F：模型组(0.47±0.03)降低，与正常组(0.65±0.05)比较，统计学有差异(P<0.05)，与保护组(0.85±0.05)比较，统计学有显著差异(P<0.01)；原代胰岛：模型组(0.43±0.06)降低，与正常组(0.62±0.06)比较，统计学有差异(P<0.05)，与保护组(0.66±0.06)比较，统计学有差异(P<0.05)。 结论： (1)半仿生提取法保持了中医复方的有效成分，具有良好的稳定性和，可重复性强，值得进一步工艺研究； (2)一定浓度的H2O2导致胰岛β细胞慢性氧化损伤，诱导其发生凋亡，通过凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax和Caspase-3激活凋亡级联反应，其调节可能与Akt失活导致的信号通路受抑有关； (3)一定剂量SQ可保护慢性氧化应激状态下胰岛β细胞的活性，SQ具有抗氧化酶活性，抵制脂质过氧化损伤，阻止其凋亡的发生和发展，参与凋亡早期的调节，通过凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax和Caspase-3抑制凋亡的发展； (4)SQ对磷酸化Akt有着重要的调节作用，SQ参与调节PI3K-Akt通路，达到抗氧化、抗胰岛细胞凋亡。 我们推论，升清降糖合剂抗糖尿病作用与其抗氧化、抗凋亡有关，并通过PI3K-Akt通路，参与胰岛素信号通路对胰岛素合成、分泌、利用的调节，达到多途径抗糖尿病的作用。