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研究背景与研究目的:早发性卵巢功能不全（Premature Ovarian Insufficiency,POI）,是指以原发或继发闭经、雌激素分泌减少、促性腺激素分泌增多、卵巢储备下降以及出现雌激素过少导致的相关症状为特征的疾病,可导致女性生育能力的下降甚至缺失,是女性不孕的一个重要原因。在年龄小于40岁的育龄女性中POI发病率约为1%,在年龄小于30岁育龄女性中POI发病率约为0.1%,且发病率近年来呈现上升趋势。POI的发病与遗传性因素、医源性因素、自身免疫性因素、代谢障碍及紊乱、病毒感染以及环境因素等方面相关。颗粒细胞（Granulosa Cells,GCs）来源于性腺索上皮,其位于卵泡内,介于膜细胞与卵母细胞之间,能够将膜细胞合成的雄激素转化为雌二醇,且兼具信息传递功能,同时还为卵母细胞提供营养支持,是卵巢中重要的功能细胞。大量研究表明GCs的增殖和凋亡与卵泡生长发育及卵巢功能密切相关。POI卵巢中GCs增殖水平低、凋亡水平高、细胞功能减退,可造成卵泡生长发育受阻甚至卵泡闭锁,进而导致女性不孕,然而目前常规的治疗手段难以有效恢复卵巢功能。随着再生医学的迅速发展,间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）在组织损伤修复中的重要作用已被证实。近年来经血源性间充质干细胞（Menstrual blood-derived stromal cells,Men SCs）疗法因其在治疗卵巢损伤性疾病中的成功应用而逐渐被人们了解并接受。本课题组已发表的实验研究结果表明,Men SCs可恢复POI小鼠卵巢功能并减少GCs凋亡。许多研究显示MSCs产生的治疗作用是通过其旁分泌途径来实现的。外泌体（Exosomes）是由MSCs通过旁分泌途径产生的一种细胞外囊泡,可通过被细胞摄取传递其所包含的蛋白质、核酸和脂质等分子来发挥治疗作用。本课题组前期实验已证实经血源性间充质干细胞来源外泌体（Men SCs-derived exosomes,Men SCs-exos）可以起到与Men SCs相似的治疗效果,即Men SCs-exos能够促进POI大鼠卵巢功能的恢复和GCs的增殖。本课题组前期质谱结果显示Men SCs-exos治疗后,POI大鼠卵巢组织中SMAD3与ZEB2表达量显著升高,但其在Men SCs-exos介导POI修复中的具体作用与机制有待阐明。此外,本课题组前期对Men SCs-exos的shotgun分析结果表明,血小板反应蛋白1（Thrombospondin 1,TSP1）是Men SCs-exos中最重要的蛋白质之一,其参与多种生物学过程,包括创伤修复、血管生成的调节以及相关信号通路的激活,然而其在介导Men SCs-exos修复POI中的作用尚不清楚。本研究旨在探究Men SCs-exos中的TSP1改善GCs生物学功能介导POI修复的分子机制,为Men SCs-exos治疗POI的临床转化提供实验依据和理论基础。研究方法:1、通过超速离心法提取正常Men SCs来源的外泌体（记为Exos）和经siRNA转染法敲除TSP1的Men SCs来源的外泌体（记为siRNA-exos）,并通过Western-blot对两种外泌体进行特异性表面标记鉴定。将通过腹腔注射VCD法（剂量为80mg/kg/d,连续15天）建立的POI大鼠模型随机分为3组（分别记为POI组、Exos组、siRNA-exos组）,正常大鼠为对照组（记为Normal组）,每组9只。每只大鼠首先给予1次卵巢原位注射（POI组大鼠每侧卵巢注射50μl的PBS;Exos组大鼠每侧卵巢注射50μl的Exos;siRNA-exos组大鼠每侧卵巢注射50μl的siRNA-exos）。于卵巢原位注射5天后继续进行尾静脉注射（POI组大鼠每只注射100μl的PBS;Exos组大鼠每只注射100μl的Exos;siRNA-exos组大鼠每只注射100μl的siRNA-exos）,5天记为一个周期,尾静脉注射共5个周期。通过阴道涂片监测POI大鼠动情周期变化。于治疗结束后通过连续交配试验统计妊娠结局以评估大鼠生育力恢复情况。各实验组大鼠称重后过量麻醉法处死,收集其卵巢组织,称重并计算卵巢器官体重比,固定24h后制作卵巢组织石蜡切片。通过卵巢组织石蜡切片HE染色、免疫组化、免疫荧光、各级卵泡计数等检测方法探究Men SCs-exos中的TSP1在介导Men SCs-exos修复POI中的作用;2、通过VCD诱导人卵巢颗粒细胞系法（KGN细胞系）建立POI体外颗粒细胞模型（记为VCD-GCs）,向VCD-GCs中加入用CM-Dil荧光标记后的外泌体,对VCD-GCs摄取外泌体的生物活动进行示踪,以证实外泌体的信息传递功能。向VCD-GCs中分别加入Exos、siRNA-exos共培养24h,分别记为Exos组、siRNA-exos组,正常KGN细胞记为Normal组,未处理的VCD-GCs记为VCD-GCs组,通过Realtime-PCR和Western-blot等检测方法对VCD-GCs中增殖凋亡表型相关指标以及通路相关指标表达水平进行检测,探究Men SCs-exos中的TSP1对VCD-GCs生物学功能的影响及分子机制;3、利用课题组前期实验样本通过卵巢石蜡切片免疫荧光和Western-blot对质谱结果进行验证,并利用本研究中实验样本通过卵巢石蜡切片免疫组化再次验证。向VCD-GCs中加入Exos+SMAD3特异性磷酸化抑制剂（SIS3）共培养24h,记为Exos+SIS3组,通过CCK8实验、流式细胞术、Realtime-PCR和Western-blot等检测方法对各实验组VCD-GCs中与细胞增殖、存活、凋亡、功能相关表型指标和相关信号通路指标进行检测,阐明Men SCs-exos中的TSP1改善VCD-GCs生物学功能的分子机制。研究结果:第一部分结果表明,Exos与siRNA-exos均表达外泌体特异性表面标记CD81和TSG101。Exos组中的POI大鼠均恢复了规律动情周期,卵巢组织学结构得到显著改善,卵巢GCs中TSP1含量显著高于POI组和siRNA-exos组,卵巢中初级卵泡、次级卵泡及窦卵泡的数量显著增加,卵巢质量和卵巢器官体重比升高,活产子代数量和质量两方面均得到显著改善且均显著优于siRNA-exos组,证实Men SCs-exos中的TSP1是介导Men SCs-exos修复POI的关键分子。此外,TSP1能够促进卵巢GCs增殖与存活,抑制凋亡,使卵巢GCs中Ki67、CREB、c-Myc表达水平显著升高,Caspase 3和Caspase 8表达水平显著下降;第二部分结果表明,外泌体能够被VCD-GCs摄取进而发挥信息传递作用,使Exos组VCD-GCs中TSP1含量显著高于VCD-GCs组和siRNA-exos组。Men SCs-exos中的TSP1能够促进VCD-GCs增殖,抑制VCD-GCs凋亡,显著提高VCD-GCs中AMH、FSHR、EGFR、CYP19A1基因的mRNA水平,进而促进VCD-GCs功能恢复。Men SCs-exos中的TSP1能够下调VCD-GCs中FOXO1、PTEN的基因表达、上调Bcl2/Bax比值与PCNA基因表达,并通过调控PI3K/AKT/MDM2/P53通路,促进GCs增殖,抑制GCs凋亡;第三部分结果表明,课题组前期质谱结果得到证实,即Men SCs-exos治疗后,POI大鼠卵巢中SMAD3和ZEB2表达水平显著升高。Men SCs-exos中的TSP1显著提高本研究中POI卵巢GCs中P-SMAD3和ZEB2表达水平,而POI组和siRNA-exos组之间无统计学差异。体外实验中Exos+SIS3组VCD-GCs增殖水平显著低于Exos组,Exos+SIS3组VCD-GCs凋亡水平显著高于Exos组,而VCD-GCs组、Exos+SIS3组和siRNA-exos组在增殖与凋亡水平方面组间均无统计学差异。Exos+SIS3组VCD-GCs中SMAD3下游基因ZEB2以及PI3K/AKT通路相关分子表达均显著低于Exos组,且Exos+SIS3组和siRNA-exos组之间以上指标均无统计学差异。Men SCs-exos中的TSP1通过调节VCD-GCs中SMAD3/ZEB2分子途径进而调控PI3K/AKT通路及其下游分子,促进VCD-GCs增殖与存活,抑制VCD-GCs凋亡,介导POI修复。研究结论:本研究证实Men SCs-exos能够恢复POI大鼠规律的动情周期,改善卵巢组织学结构,增加POI卵巢中初级卵泡、次级卵泡及窦卵泡数量,提高POI大鼠生育力进而改善妊娠结局,其中所含的TSP1是介导Men SCs-exos修复POI的关键分子。Men SCs-exos中的TSP1通过调节GCs中SMAD3/ZEB2分子途径,进而调控PI3K/AKT通路及其下游分子,促进其增殖与存活,抑制凋亡,改善其生物学功能,介导POI修复。