背景及目的梗阻性肾病（obstructive nephropathy,ON）是指泌尿系结石、输尿管狭窄、膀胱功能障碍等肾后性因素致尿液排出障碍,出现肾积水,造成肾实质损伤和肾脏功能受损的慢性肾脏疾病。ON临床多见,肾脏纤维化是其病理演变结局,当发生肾积水时,肾小管扩张,尿液渗入组织间隙,激活一系列纤维化机制,大量胶原纤维沉积,功能结构被替代;临床治疗首选手术解除尿路梗阻,以挽救肾功能,但许多患者手术后肾功能未见明显恢复,一部分出现进行性加重。究其原因可能与梗阻性肾脏纤维化（Obstructive renal fibrosis,ORF）的进行性发展有关,目前缺乏有效的措施来阻止和逆转ORF的进展,其分子机制的研究仍然有很多不清楚之处,深入研究仍然十分必要。在真核生物中含量最高的RNA修饰方式是N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）修饰,是表观遗传学的重要内容,高度保守,是指在甲基化酶或去甲基化酶的作用下,RNA中碱基腺嘌呤的第6位N原子上添加或去除甲基基团,并由阅读蛋白识别;已经发现的RNA m6A甲基化酶包括肾母细胞瘤1相关蛋白（Wilms tumor 1-associating protein,WTAP）、甲基转移酶样蛋白 3（Methyltransferase-like protein 3,METTL3）、病毒样 m6A 转移酶相关蛋白（Vir-like m6A methyltransferase-associated protein,KIAA1429）、甲基转移酶样蛋白 14（Methyltransferase-like protein 14,METTL14）,其中 METTL3,WTAP和METTL14以功能复合物的形式存在,去甲基化酶包括脂肪量和肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity associated protein,FTO）和 ALkB 同系物 5（AlkB homolog 5,ALKBH5）,生物组织中RNA m6A修饰水平是不断变化和动态可逆的。RNA m6A修饰在人体器官纤维化过程中的作用在很多文献中已有阐明,目前的研究多认为RNA m6A水平在纤维化发展中是升高的,并发挥着促进作用,而且涉及细胞凋亡、炎症、氧化应激及非编码RNA调节等多种机制,但其在ORF中的相关研究十分有限。近年来,肾纤维化发生发展的机制研究逐渐从蛋白质和mRNA转向非编码RNA,包括 microRNAs、lncRNAs 和 circRNAs。microRNAs 在动植物基因组中的作用已有详细研究。绝大多数microRNAs由21-23个核苷酸组成,通过与靶基因上的特定位点结合,影响许多基因的mRNA降解和蛋白质合成,从而参与多种生物学过程。众多研究报道已证实microRNAs在肾脏纤维化的发生发展中发挥重要作用,其中miR-21是肾脏纤维化领域中最常被提及的microRNAs之一,包括miR-21-5p和miR-21-3p两种不同命名的亚型,分别表明从miR-21前体的5’端和3’端经加工而来;许多肾脏纤维化模型及临床肾脏样本中均可发现miR-21的表达失调,并且多数研究一致认为miR-21具有促进肾脏纤维化发展的功能,但其在ORF中的成熟过程和下游信号通路尚不清楚,值得进一步探讨;SPRY1是miR-21的直接靶点,研究报道SPRY1在血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肝纤维化和博莱霉素诱导的肺纤维化中具有抑制ERK/NF-κB通路的作用,而ERK/NF-κB通路在器官纤维化炎症的发生和发展中又扮演重要角色;那么miR-21是否通过靶向SPRY1激活ERK/NF-kB信号通路,促进梗阻性肾脏的炎症发展,进而促进ORF尚未确定。成熟的microRNAs起源于被称为pri-microRNAs的长初级转录本,在细胞核中pri-microRNAs 被迪乔治综合征危象区基因 8（DiGeorge syndrome critical region 8,DGCR8）和核糖核酸酶 Ⅲ（Ribonuclease Ⅲ enzymes,DROSHA）形成的微处理器复合体识别,研究揭示哺乳动物中m6A修饰能够标记pri-microRNAs,进而被DGCR8识别参与microRNAs的成熟,改变m6A水平可能影响pri-microRNAs的加工,进而改变成熟microRNAs的表达水平,最终影响生物学过程。此前的一项研究报道,m6A参与miR-126的成熟,并推动肺纤维化的发展,那么在ORF中m6A修饰是否影响了 miR-21的成熟,进而调节下游通路参与肾脏纤维的发展过程有待研究。本研究中我们收集临床正常和梗阻肾脏标本,构建小鼠单侧输尿管梗阻模型（Unilateral ureteral obstruction,UUO）,应用条件性敲除肾脏 METTL3 基因小鼠和质粒转染增强或抑制人肾近端小管上皮细胞（Human renal proximal tubular epithelial cell,HK-2）中METTL3及miR-21-5p的表达,探讨梗阻性肾纤维化中METTL3/m6A介导miR-21-5p的成熟激活下游SPRY1/ERK/NF-κB通路和炎症反应的分子机制,因此我们的研究分为以下四部分:第一部分成人梗阻肾脏中m6A修饰和miR-21-5p的表达目的检测成人梗阻肾脏组织中m6A水平及m6A相关酶的表达,并检测miR-21-5p及其下游SPRY1/ERK/NF-κB通路的变化,初步探讨梗阻肾脏中m6A修饰和miR-21-5p所发挥的作用。材料及方法1.梗阻肾脏组:收集了 28例因泌尿系梗阻导致严重肾积水、肾功能丧失行肾脏切除的肾脏标本。对照组:肾癌患者行根治性肾切除术,在距肿瘤部位至少5 cm且无明显肿瘤侵犯的区域取肾标本作为正常肾组织对照,共收集16例。2.采用HE和Masson染色分析肾脏的病理变化和胶原沉积情况。3.应用western blot和免疫组化技术检测梗阻肾脏和正常肾脏组织中纤维化指标α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin（FN）蛋白表达水平。4.应用RNA dot blot技术检测梗阻肾脏和正常肾脏组织m6A水平。5.应用qRT-PCR检测梗阻肾脏和正常肾脏组织中m6A相关甲基化酶METTL3、KIAA1429、METTL14、WTAP 和去甲基化酶 ALKBH5、FTO 的表达水平。6.应用qRT-PCR检测梗阻肾脏和正常肾脏组织中miR-21-5p的表达水平,western blot检测其下游SPRY1/ERK/NF-κB通路和炎症因子TNF-α、IL-6的表达水平。7.统计学分析:使用SPSS21.0软件,计量资料使用均值±标准差（mean± SD）表示。两组之间的比较分析使用独立样本t检验进行,单因素方差分析则用于三组和三组以上的比较,检验水准为α=0.05,P＜0.05表示差异有统计学意义。结果1.HE染色显示相比对照组,梗阻肾脏的结构发生了改变,肾脏皮质明显变薄,正常皮质结构破坏,肾小球硬化萎缩,肾小管扩张,存在管型,间质大量炎症细胞浸润,髓质远端小管也发生萎缩硬化。2.Masson染色结果显示胶原纤维大量生成并沉积在梗阻肾脏组织间隙,相互连接形成网格状,正常的组织结构遭到破坏,肾小球萎缩硬化,胶原沉积面积较对照组明显增加（P＜0.05）。3.Western blot和免疫组化检测结果显示梗阻肾脏中纤维化指标α-SMA、Collagen Ⅰ、FN的蛋白表达较对照组明显升高（P＜0.05）。4.RNA dot blot检测提示成人梗阻肾脏组织中m6A水平明显升高。甲基化酶和去甲基化酶的qRT-PCR检测结果提示甲基化酶METTL3的表达变化最为突出（P＜0.05）,western blot和免疫组化检测结果同样证实了成人梗阻性肾脏组织中METTL3的表达升高。5.qRT-PCR结果提示miR-21-5p在梗阻肾脏组织中表达明显增加（P＜0.05）,western blot提示SPRY1的蛋白表达在梗阻肾脏组织中下降,而p-ERK和p-NF-κB的蛋白表达升高,同时炎症因子TNF-α、IL-6的蛋白表达升高（P＜0.05）。小结本部分结果证实成人梗阻肾脏发生了明显纤维化,m6A修饰水平升高,在甲基化酶和去甲基化酶中METTL3表达升高最明显,为介导m6A升高的主要作用酶,并观察到梗阻肾脏中miR-21-5p的表达上调及信号通路SPRY1/ERK/NF-κB的激活,这些发现为深入研究梗阻性肾脏纤维化提供线索。第二部分METTL3/m6A和miR-21-5p在梗阻性肾脏纤维化发展中的作用目的构建小鼠不同梗阻时间的肾脏积水模型,观察不同梗阻时间下METTL3/m6A、miR-21-5p 及下游 SPRY1/ERK/NF-κB 通路的变化,探讨 METTL3/m6A 和miR-21-5p在梗阻性肾脏纤维化发展中的作用。材料及方法1.用60只C57BL/6小鼠构建单侧输尿管梗阻模型（UUO）,随机分为UUO组和Sham组（假手术组）,每组30只,分别在手术后第3天,第7天,第14天用小动物超声观察肾脏积水情况,并测量肾盂宽度,留取下腔静脉血检测肾脏功能,处死小鼠获得左侧肾脏标本,每个时间点10只小鼠。2.HE及Masson染色分析肾脏不同梗阻时间的病理变化和胶原沉积情况。3.应用qRT-PCR,western blot或免疫组化技术检测纤维化指标α-SMA、Collagen Ⅰ、FN的mRNA及蛋白表达水平。4.应用RNA dot blot检测肾脏不同梗阻时间的m6A水平变化,应用免疫组化或western blot技术分析METTL3不同梗阻时间的表达水平变化。5.应用qRT-PCR检测肾脏不同梗阻时间下miR-21-5p的表达变化,western blot检测SPRY1/ERK/NF-κB通路蛋白表达,western blot和免疫组化检测炎症因子TNF-α、IL-6的表达。6.统计学分析:使用SPSS21.0软件,计量资料使用均值±标准差（mean±SD）表示。两组之间的比较分析使用独立样本t检验进行,单因素方差分析则用于三组和三组以上的比较,检验水准为α=0.05,P＜0.05表示差异有统计学意义。结果1.小鼠左侧输尿管结扎后随着梗阻时间的增加,超声显示左肾皮质厚度逐渐变薄,肾盂宽度逐渐增加（P＜0.05）,说明UUO模型的构建成功,肾功能生化检测显示由于右肾功能的代偿,血清肌酐（Serum creatinine,SCr）和血尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）水平大致在正常范围内;但随着左肾尿液的积聚,BUN和SCr的上升趋势仍然很明显（P＜0.05）。2.HE染色显示肾皮质近端小管扩张并随着梗阻时间的延长而加重,肾小管结构受损,许多肾小球塌陷,炎症细胞大量浸润,尤其是梗阻7天和14天的肾脏,甚至形成炎症灶,肾小管的间质损伤评分逐渐升高（P＜0.05）,Masson染色显示随着梗阻时间的增加,胶原沉积面积逐渐扩大（P＜0.05）。3.qRT-PCR 结果显示α-SMA、Collagen Ⅰ 和 FN 的 mRNA 表达水平在 UUO-7d和UUO-14d组显着增加（P＜0.05）;与此相一致的是western blot和免疫组化染色显示α-SMA、Collagen Ⅰ和FN表达随着梗阻时间的增加而上调,证实小鼠梗阻性肾脏纤维化的发生,并随着梗阻时间的增加而加重（P＜0.05）。4.RNA dot blot检测结果显示UUO术后小鼠肾脏组织的m6A水平随梗阻时间的延长而升高;western blot检测结果显示METTL3蛋白表达在UUO术后明显上调,尤其是UUO-7d组和UUO-14d组（P＜0.05）;METTL3免疫组化染色结果与western blot检测结果一致（P＜0.05）,METTL3/m6A修饰水平的变化趋势与纤维化发展趋势一致。5.qRT-PCR检测miR-21-5p的表达发现随着梗阻时间的延长miR-21-5p的表达逐渐升高（P＜0.05）,并伴随着p-ERK、p-NF-kB蛋白表达上调和SPRY1蛋白表达下调（P＜0.05）,同时western blot和免疫组织化学染色结果显示炎症因子TNF-α、IL-6的表达也随着梗阻时间延长而升高（P＜0.05）。小结本部分构建小鼠UUO模型,观察到随着肾脏梗阻时间的延长,纤维化逐渐加重,METTL3/m6A修饰水平的变化趋势与纤维化发展趋势一致,并且随着梗阻性肾脏纤维化的发展,miR-21-5p的表达逐渐上调,SPRY1/ERK/NF-κB通路激活和炎症反应加重,因此METTL3/m6A和miR-21-5p与梗阻性肾脏纤维化的发展密切相关。第三部分敲除肾脏METTL3基因对miR-21-5p及梗阻性肾脏纤维化的影响目的通过条件性敲除小鼠肾脏METTL3基因改变m6A水平,探讨干预METTL3/m6A对miR-21-5p的表达和对梗阻性肾脏纤维化的治疗作用。材料及方法1.肾脏METTL3基因敲除（KO）小鼠和野生型（WT）C57BL/6小鼠各20只,分组:野生型小鼠Sham组（WT-Sham组）10只,野生型小鼠UUO组（WT-UUO组）10只,METTL3基因敲除小鼠Sham组（KO-Sham组）10只,METTL3基因敲除小鼠UUO组（KO-UUO组）10只。2.通过Masson染色分析各组肾脏组织中胶原纤维的增生沉积。3.应用组织免疫荧光检测各组肾脏组织中METTL3和Collagen Ⅰ的表达变化。4.免疫组化分析METTL3、α-SMA和FN在各组肾脏组织中的表达变化。5.RNA dot blot检测各组肾脏组织的m6A水平变化。6.各组肾脏组织中miR-21-5p的表达水平采用qRT-PCR分析检测,各组肾脏组织中炎症因子TNF-α、IL-6的蛋白水平使用western blot来检测。7.统计学分析:使用SPSS21.0软件,计量资料使用均值±标准差（mean±SD）表示。两组之间的比较分析使用独立样本t检验进行,单因素方差分析则用于三组和三组以上的比较,检验水准为α=0.05,P＜0.05表示差异有统计学意义。结果1.Masson染色分析提示WT-Sham组和KO-Sham组的肾脏间质中未见过多的胶原纤维,差异无统计学意义,P＞0.05;KO-UUO组肾脏间质胶原纤维沉积与WT-UUO组相比明显改善,有统计学差异,P＜0.05。2.组织免疫荧光检测显示Collagen Ⅰ蛋白的荧光强度在WT-UUO组明显增强,相较于WT-Sham组和KO-Sham组,KO-UUO组Collagen Ⅰ蛋白的荧光强度有所升高,但与WT-UUO组相比明显降低（P＜0.05）。3.免疫组化的结果显示在WT-UUO组α-SMA的表达水平上调明显,KO-UUO组与WT-UUO组相比α-SMA的表达水平明显下调（P＜0.05）;FN蛋白的免疫组化检测结果变化趋势与α-SMA一致,即在WT-UUO组明显上调,而KO-UUO组与WT-UUO组相比明显降低（P＜0.05）。4.Dot blot结果显示WT-UUO组小鼠肾脏组织m6A水平较WT-Sham组升高,敲除METTL3基因则明显降低KO-UUO组小鼠肾脏组织m6A水平。5.qRT-PCR检测结果显示WT-UUO组miR-21-5p表达明显上调,而敲除METTL3基因的KO-UUO组小鼠肾脏组织miR-21-5p的表达明显受到了抑制（P＜0.05）;各组的western blot检测结果显示在WT-UUO组炎症因子TNF-α和IL-6的表达明显升高,而KO-UUO组中敲除METTL3基因后则能够降低TNF-α和IL-6的表达（P＜0.05）。小结本部分证实敲除METTL3基因降低梗阻肾脏组织m6A水平,能够明显缓解梗阻性肾脏纤维化,并且敲除METTL3基因抑制了梗阻肾脏组织中miR-21-5p的表达和炎症反应,进一步说明METTL3/m6A的促纤维化作用与miR-21-5p密切相关。第四部分METTL3/m6A介导miR-21-5p成熟调控肾脏纤维化的机制研究目的通过增强或抑制HK-2细胞中METTL3和miR-21-5p的表达,探讨METTL3/m6A介导miR-21-5p的成熟激活SPRY1/ERK/NF-κB信号通路调控肾纤维化的分子机制。材料及方法1.HK-2是在5%CO2的湿化环境中,维持37℃培养;按1×105/孔的细胞密度将HK-2接种在6孔板上,按照Lipofectamine 3000试剂盒中的说明书进行转染操作,转染48小时后,收集细胞用于后续实验。2.HK-2细胞经过PGV657-METTL3质粒转染过表达METTL3后,采用western blot 检测 METTL3、α-SMA、Collagen Ⅰ 和 FN 的表达;采用 RNA dot blot 分析转染后m6A修饰水平的变化;pri-miR-21和miR-21-5p的表达采用qRT-PCR分析;以m6A抗体进行RNA免疫沉淀实验（RNA immunoprecipitation,RIP）检测被m6A修饰的pri-miR-21水平变化,以DGCR8抗体进行RIP实验检测与DGCR8结合的pri-miR-21水平变化。3.向 HK-2 细胞中转染 miR-21-5p-mimics 过表达 miR-21-5p 后,qRT-PCR 检测miR-21-5p 的表达;western blot 检测 Collagen Ⅰ、FN、SPRY1、p-ERK/ERK、p-NF-κB/NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白表达变化;细胞免疫荧光检测α-SMA的表达变化。4.PGV657-METTL3 质粒与 miR-21-5p-inhibitor 共转染 HK-2 细胞,细胞免疫荧光检测 METTL3 和α-SMA 的表达;western blot 检测α-SMA、Collagen Ⅰ、FN的表达。5.统计学分析:使用SPSS21.0软件,计量资料使用均值±标准差（mean±SD）表示。两组之间的比较分析使用独立样本t检验进行,单因素方差分析则用于三组和三组以上的比较,检验水准为α=0.05,P＜0.05表示差异有统计学意义。结果1.向HK-2细胞中转染pGV657-METTL3质粒过表达METTL3基因后,RNA dot blot结果显示相比空白载体对照组m6A修饰水平明显升高,同时qRT-PCR分析提示目的基因转染后提高了 miR-21-5p的表达,而pri-miR-21水平降低（P＜0.05）,说明过表达METTL3促进了 miR-21-5p的成熟,同时western blot结果显示目的基因转染组与对照组相比α-SMA、Collagen Ⅰ、FN蛋白表达水平升高（P＜0.05）,说明过表达METTL3基因促进了 HK-2细胞的纤维化。2.向HK-2细胞转染pGV657-METTL3质粒后,细胞免疫荧光结果显示α-SMA蛋白的荧光显色增强;而共转染miR-21-5p-inhibitor后显示α-SMA蛋白的荧光显色明显降低,同时western blot结果显示与pGV657-METTL3质粒转染组相比质粒共转染组α-SMA、Collagen Ⅰ、FN的蛋白表达明显降低（P＜0.05）,进一步证实了 HK-2细胞中过表达METTL3的促纤维化作用可能是通过促进miR-21-5p的成熟表达实现的。3.DGCR8抗体进行的RIP实验结果显示过表达METTL3基因的HK-2细胞中,pri-miR-21与DGCR8的结合水平显著升高（P＜0.05）;用m6A抗体实施的RIP实验提示过表达METTL3基因后,经m6A修饰的pri-miR-21水平明显升高（P＜0.05）,说明过表达METTL3基因促进了 pri-miR-21的m6A修饰,增强了pri-miR-21与DGCR8蛋白的结合,进而促进pri-miR-21的成熟加工,同时使用预测系统 SRAMP（http://www.cuilab.cn/sramp/）分析 pri-miR-21 的 m6A 修饰位点,共发现7个m6A修饰位点,其中2个为高置信位点。4.细胞免疫荧光结果显示向HK-2细胞转染pGV514-miR-21-5p-mimic质粒后,与空白载体对照组相比α-SMA蛋白的荧光显色增强,同时western blot结果显示与空白载体对照组相比Collagen Ⅰ、FN、TNF-α、IL-6的蛋白表达升高（P＜0.05）,说明HK-2细胞中过表达miR-21-5p明显促进纤维化及炎症因子的表达,western blot检测还显示p-ERK1/2,p-NF-κB表达水平升高,而SPRY1表达受到抑制（P＜0.05）,说明 HK-2 细胞中过表达 miR-21-5p 激活 SPRY1/ERK1/2/NF-κB 通路。小结本部分体外细胞实验证实了 METTL3/m6A修饰介导pri-miR-21的加工剪辑,进而促进miR-21-5p的成熟,结果支持METTL3/m6A修饰是通过促进miR-21-5p成熟表达,进而激活SPRY1/ERK/NF-κB信号通路和炎症反应促进肾脏纤维化。结论1.在梗阻肾脏中,METTL3介导了 m6A修饰水平的升高。2.METTL3/m6A通过促进miR-21-5p的表达和炎症反应促进梗阻性肾脏纤维化发展。3.敲除肾脏METTL3基因能够抑制梗阻肾脏组织中miR-21-5p的表达和炎症反应,改善梗阻性肾脏纤维化。4.METTL3介导pri-miR-21的m6A修饰促进miR-21-5p成熟,进而激活SPRY1/ERK/NF-κB通路调节肾脏纤维化。