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植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CYS)是在植物体内能可逆地抑制半胱氨酸蛋白酶活性的一类蛋白家族。CYS基因已在拟南芥、水稻、大豆等多种植物中被鉴定，并揭示了该类基因在不同物种中的结构特征和生物学功能。苹果属于喜硝植物，氮胁迫会严重影响苹果的生长发育、果实品质和产量。有关苹果CYS基因在氮胁迫下的功能研究，尚未见报道。本课题前期鉴定了苹果cystatins基因家族成员，在富平楸子中克隆出MpCYS4基因（即MdCYS21），并获得过表达MpCYS4基因的M26转基因植株。本研究在此基础上，系统的分析了苹果CYS基因在低氮胁迫下的表达的变化。采用组培、沙培和水培的实验手段研究了MpCYS4转基因植株对低氮胁迫的抗性。获得如下结果: 1、苹果砧木M26低氮胁迫处理的结果表明:低氮处理显著抑制了M26的生长。低氮处理组M26的干重、株高、茎粗、叶绿素含量、净光合速率等指标显著小于对照组，植株表现出典型的缺氮症状。在课题前期研究基础上，选取6个苹果CYS基因，分析其在低氮胁迫下的表达发现，这6个基因均受低氮胁迫的诱导，表达量上调显著。初步确认选取的6个苹果CYS基因(MdCYS1、MdCYS8、MdCYS15、MdCYS20、MdCYS21、MdCYS26)均参与了M26低氮响应过程。 2、组培法研究MpCYS4基因响应低氮胁迫的结果表明:极低氮处理和无氮处理，转基因植株生长势优于野生型。并且，转基因植株的根系的根的数目、长度、表面积等方面明显大于野生型。初步表明MpCYS4基因的过量表达增强了M26对氮胁迫的抗性。 3、沙培法研究MpCYS4基因响应低氮胁迫的结果表明:低氮条件下，M26转基因植株的根部和地上部的生物量、光合色素含量和净光合速率明显大于野生型，但是根冠比小于野生型。同时，MpCYS4基因的过量表达，导致低氮胁迫下叶片的气孔导度下降，叶片中H2O2积累量显著降低，而且成熟叶片中全氮含量大于野生型。 4、水培法研究MpCYS4基因响应低氮胁迫的结果表明:低氮条件下，M26转基因植株的根部和地上部的生物量、光合色素含量明显大于野生型。M26转基因植株中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性显著大于野生型，叶片中的H2O2积累量显著低于野生型植株。M26转基因植株叶片中硝酸根转运蛋白基因MdNPF6.8、MdNPF6.9、MdNRT2.4和MdNRT2.7的表达量上调显著。 综上所述，通过低氮胁迫下M26的表型与苹果CYS基因表达，及过表达MpCYS4转基因M26植株对低氮胁迫的抗性的关联分析，初步确定苹果CYS基因参与了植物的低氮响应。