埃立克体是Anaplasmataceae科中的一类严格胞内寄生、以蜱虫为主要传播媒介的革兰氏阴性微生物,其具有广泛的感染宿主谱。根据16SrRNA基因和其他相关基因的序列,百前 Ehrlichia 属包括 5个种:Ehrlichia canis、E.chaffeensis、E.ruminantium、E.ewingii、E.muris。其中E.chaffeensis主要在人群中流行,并引起人单核细胞埃立克体病(human monocytic ehrlichiosis,HME);E.ruminantium主要感染反刍动物,如牛、绵羊、山羊等,给相关的养殖业带来了巨大的经济损失;而E.canis是一种主要感染犬科动物导致犬单核细胞埃立克体病(canine monocytic ehrlichiosis,CME)的人兽共患传染性病原体。E.canis感染犬之后主要表现为发热、精神沉郁、厌食、眼鼻分泌物增多等临床症状,并可分为急性感染期、亚临床症状期、慢性感染期三个阶段。作为一种重要的人兽共患传染性病原体,E.canis主要感染犬科动物尤其是伴侣动物给人类健康带来了巨大的威胁。本研究通过建立一种可以同时检测所有埃立克体的FRET-qPCR方法并将其应用于我国的伴侣动物和反刍动物样品中,从而调查我国埃立克体病的流行现状;并通过犬巨噬细胞系,在体外培养获得E.canis YZ1菌株;同时,对其与细胞自噬的关系做了初步探索;进一步对其全基因组序列进行测定和分析;通过实验比格犬模型,对此分离株的致病性、治疗等进行了系统地研究。一、检测所有埃立克体种的FRET-qPCR方法的建立目前,埃立克体属得到认可的种主要有5个,但同时随着检测技术和分子生物学技术的不断发展越来越多的对养殖业、人和动物健康具有巨大威胁的菌株被发现,如Panola Montain Ehrlichia(PME)等。但现在的血清学检测方法在埃立克体属内部甚至Anaplasmataceae科内部存在交叉反应,而目前已有的PCR检测方法只能检测单个或部分埃立克体种或者无法区分与埃立克体同源性相近的其他虫媒病原体。本研究根据16S rRNA基因中保守区间设计了一对引物和一对探针,建立了一种可以在单个反应孔中同时检测并分型所有常见埃立克体种的FRET-qPCR方法,并可以通过高分辨率熔解曲线分析中Tm值的不同将所有埃立克体分为4个组:E.ruminantium(Tm～55.8℃),E.chaffeensis 和 E.ewingii(Tm～57.7℃),E.canis、E.muris、E.ovina 和 Ehrlichia sp.BOV 2010(Tm～62.0℃),the Panola Mountain Ehrlichia(Tm～65.5℃);且此检测方法具有极高的灵敏度,可以在每个反应孔中最低检测到单个拷贝的病原体核酸。本研究更进一步通过将此灵敏特异的FRET-qPCR应用于5个加勒比海岛的反刍动物样品中埃立克体病流行现状的调查之中进一步验证了此方法的可行性,且结果表明其中有12.2%(134/1,101)的动物感染了埃立克体病原体,其中包括牛76份(19.7%,76/385),绵羊45份(13.2%,45/340)、山羊13份(3.5%,13/376);进一步通过巢式PCR和基因测序发现所有感染的埃立克体为E.canis或者与其同源性及其相近的埃立克体菌株。二、我国伴侣动物和反刍动物埃立克体病的分子流行学调查我国具有悠久的宠物饲养和野生动物驯化为家畜饲养的历史,近年来随着我国经济的飞速发展,畜牧养殖业得到了长足发展,家畜存栏量位居世界前列;同时随着居民生活水平的不断提高,宠物数量也在逐年增加。与此同时,家畜和伴侣动物中传染病尤其是人畜共患传染病数量也在不断增加,给人类食品安全和生命健康带来了巨大威胁,尤其是其中的虫媒疾病等慢性传染病,大大降低了家畜的经济价值。为了进一步了解埃立克体病在我国伴侣动物和反刍动物中的流行现状,我们通过分子生物学方法对来自我国10个省份12城市的1,114份犬血液样品及其体表寄生虫(146份蜱虫、37份虱子)和12省份的2,240份反刍动物样品中埃立克体病的流行现状进行了调查。结果显示,有15份犬血液样品(1.3%,15/1,114)、6份蜱虫样品(4.1%,6/146)中具有埃立克体的核酸,且通过进一步确定其为E.canis;同时,2份绵羊样品(0.8%,2/111)、3份山羊样品(1.1%,3/270)、65份牛样品(3.6%,65/1,830)、0份水牛样品(0/29)表现为埃立克体核酸阳性,进一步通过gltA基因确定,感染的埃立克体为E.canis或与其及其相近的埃立克体菌株。三、Ehrlichia canis的体外分离培养Ehrlichia cani是一种严格胞内寄生的革兰氏阴性微生物,其脱离宿主细胞后2-3小时即会死亡。该病原体首次于1935年的阿尔及利亚被发现,我国于1999年在军用犬中首次报道。E.canis最初通过培养阳性感染犬的单核细胞来保存病原体,随后通过阳性感染的单核细胞接种于未感染的细胞获得持续培养,并最后通过DH82犬巨噬细胞系获得持续传代培养,随后又在人-犬杂交细胞系、人微血管细胞、BALB/C小鼠巨噬细胞,以及蜱虫细胞系IDE8、ISE6、IRE/CTVM18中获得了体外培养。我国也通过保存阳性感染犬的淋巴细胞保存了E.c ni 病原体,但目前为止还没有体外传代培养的报道。本研究通过DH82犬巨噬细胞从阳性感染犬的淋巴细胞中成功在体外培养了 E.canis病原体,并获得了持续传代培养;同时,成功在Vero非洲绿猴肾细胞中获得持续培养。通过吉姆萨染色,本研究观察研究了 E.canis在感染DH82细胞和Vero细胞后的第1、2、3天不同时期时细胞内的形态特征,并成功观察到其在感染细胞内形成的内涵体(morula)形态特征。四、Ehrlichia canis YZ1菌株全基因组测序及比较基因组学分析本研究通过第三代测序技术,对我国首次分离获得的E.canis YZ1株病原体进行了全基因组测序及分析,并在世界范围内获得了第二个E.canis的全基因组序列。获得E.canis YZ1菌株的基因组总长度为1,314,789 bp,其中编码基因长度为956,238 bp,共编码1,022个基因,基因组中%GC为29.0%;其中有65个散在重复序列和158个串联重复序列;同时预测到一个长度为44,886 bp的基因岛。通过与rRNA库比对后共找到36个tRNA可以转运20种氨基酸,1个5SrRNA,1个16S rRNA和1个23SrRNA。通过对所有基因进行功能分析,共获得GO功能注释结果2,959个,其主要集中在细胞过程和新陈代谢过程;其中537个基因与KEGG代谢通路有关,而且74个与翻译生物过程有关;其中757个基因的氨基酸序列与COG生物功能有关,且135个与翻译、核糖体组成和生物合成有关。通过与其他6株埃立克体菌株(E.cani strain Jake,E.ruminantium,E.muris,E.chaffeensis,E.mineirensis,Ehrlichia sp.)进行共线性分析,其中只有E.canis Jake 菌株参考基因组中99.3%的部分与E.canis YZ1菌株基因组中的99.3%的序列参与了线性化比对,而其他5个参考序列参与比对时E.canis YZ1菌株参与部分低于80%、参考序列低于90%,共线性较差。将E.canis YZ1菌株与参考序列进行全局比对,与E.canis参考序列相比具有最少的(1,748个)在基因水平上由单个核苷酸变异引起的潜在的DNA序列多态性SNP位点;E.canis YZ1菌株基因组CDS内部存在多个插入和缺失突变类型。同时,E.canis YZ1菌株的起始段和末尾段与E.canis strain Jake参考基因组序列相比存在倒置和易位突变。五、细胞自噬在Ehrlichia canis感染中作用机制的初步研究Ehrlichia canis是一种严格胞内寄生、主要感染犬科动物的蜱传病原体,主要引起犬单核细胞埃立克体病。虽然E.canis的宿主谱很广,其中也有感染人的报道,但是截至目前还没有自噬在E.canis感染宿主细胞时作用方式的相关研究。本研究通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白印记、免疫荧光等多种方法对E.canis感染DH82细胞和Vero细胞时自噬相关蛋白的变化情况进行了研究。结果显示,E.canis感染的犬巨噬细胞和猴肾细胞中LC3蛋白表达量上升、p62蛋白表达量少量下降;GFP-LC3标记的质粒转染进入细胞后出现了点状聚集且集中于病原体周围,且LC3双荧光慢病毒感染细胞后出现了红色和绿色荧光的叠加,且绿色荧光未发生明显的降解;同时,RAB5也在包被病原体的膜结构表面形成点状聚集;通过自噬抑制剂bafilomycin、3-MA和自噬促进剂rapamycin处理E.canis感染的细胞并分别作用于溶酶体、PI3K和mTOR后,病原体的增殖速率均得到了提升。由此说明,自噬相关蛋白LC3、p62、RAB5、PI3K等均参与了E.canis感染宿主细胞的过程;同时,病原体E.canis可以利用宿主细胞自噬过程获得营养物质进行扩增繁殖;而且,E.canis感染后形成内涵体后不会与溶酶体结合,从而可以逃避宿主细胞的对外来物质的清除作用。但是这些蛋白在感染过程中如何发挥作用的及具体机制仍需进一步研究。六、Ehrlichia canis犬感染模型的建立Ehrlichia canis是一种可以同时感染人、犬科动物、猫科动物等多种生物的广谱性虫媒病原体,其感染之后可以表现为发热、沉郁、厌食、血小板降低等多种临床症状。为了更进一步地了解E.canis在感染犬之后的临床症状、病理变化、治疗方案等,本研究以比格犬为动物模型通过接种细胞培养的E.cani 病原体后检测其各种生理指标变化、病理变化等来研究E.canis的致病性等。实验犬在首次感染E.canis后首先进入急性感染期,主要表现为发热、厌食、精神沉郁、眼鼻分泌物增多等;在此期间血液中血小板下降明显,白细胞数、淋巴细胞数、单核细胞数、粒细胞数等免疫细胞显著降低;血清中碱性磷酸酶升高明显;血清中相关细胞因子浓度没有明显变化,组织脏器中淋巴结、脾脏、肝脏中CD8B、IL17A、IL10细胞因子变化明显。通过FRET-qPCR对血液中病原体含量进行定量,其在感染之后迅速增殖并达到较高滴度后维持在感染的动物体内。通过不同药物治疗感染犬后发现,盐酸多西环素和利福平对缓解CME症状都有显著效果,但多西环素可以将病原体从机体内完全清除且作用更迅速。在实验结束后对动物进行安乐死处理,通过组织病理切片可以观察到肺脏、肾脏、肝脏、脾脏等表现为局部坏死、淋巴细胞浸润、炎性增生等病理变化,同时可以观察到大脑出现脑膜炎性病变。作为生物机体内最大的免疫器官,脾脏在抵御疾病感染的过程中发挥着重要作用,为了验证其在E.canis感染中的作用,本研究探索了脾脏的摘除与否对病原体感染的影响。脾脏摘除的实验感染犬在病原体E.canis感染后体温升高更迅速且峰值更高、体内病原体增殖速率更快且滴度更高、血液中各种免疫细胞变化更明显。但与此同时,不同性别的实验动物在E.canis感染、治疗、二次感染、混合感染等阶段未表现出明显差异。本研究首次全面系统地以实验犬为模型对E.canis的感染、治疗、二次感染、与蜱传病原体Babesia vogeli混合感染等多种不同条件下动物机体在体表症状、体内病原体增殖速率、血液生理指标变化、组织病理学变化等情况进行了研究,为E.canis预防、检测、诊断、治疗等提供了理论支持。