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家蚕是鳞翅目的一种重要经济昆虫,其在上蔟期吐出的蚕丝蛋白经工艺加工制成丝织品,具有重要的经济价值。中国不仅是世界蚕丝业的起源地,也是世界丝绸产量大国之一。举世闻名的丝绸之路不仅带动了中国的经济发展,还加强了中国与其他国家的文化交流。蚕丝业因此被誉为我国的第五大发明。丝腺是家蚕体内能够分泌蚕丝蛋白的唯一器官,根据其功能和结构的不同,丝腺可分为前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺三个部分。后部丝腺分泌的丝素蛋白,被中部丝腺分泌的丝胶蛋白包裹后,经由前部丝腺吐出体外,形成蚕丝。不同品种蚕的产丝量有所不同,这主要是由于不同品种蚕的丝腺发育存在差异。高产丝量家蚕品种的选育一直是蚕业研究的重要部分,提高家蚕的产丝量有利于蚕丝业的发展。因此,研究丝腺发育的机制有利于我们更好的了解丝腺发育与家蚕产丝量之间的关系,为家蚕高产丝量品种的遗传改良提供理论指导,具有重要的意义。丝腺的发育主要包括丝腺胚胎发育和胚后发育。丝腺在胚胎期形成一定数目的丝腺细胞,在幼虫期丝腺进行核内复制,细胞数目不再发生改变,细胞体积增大。近年来关于丝腺发育的研究主要集中于丝腺的核内复制。已有研究表明,Ras1~CA、Myc等基因能够调控丝腺的核内复制,影响细胞大小。Bm Fox A基因是在家蚕丝腺中鉴定的Fox A家族转录因子。早期文献报道,Bm Fox A在家蚕体节的异位表达会导致丝腺的异位诱导,表明Bm Fox A对丝腺的发育可能存在调控作用。此外,在Ras1~CA过表达的家蚕中也检测到Bm Fox A的上调表达。基于以上的研究结果,我们猜测Bm Fox A基因可能参与了丝腺的发育调控。我们设计实验对这一猜测进行了研究,研究结果如下:1.转基因敲除个体的获得和检测我们构建了Bm Fox A转基因敲除g RNA载体,胚胎期显微注射,筛选获得Bm Fox A的g RNA阳性个体,将其与丝素基因启动子驱动表达Cas9蛋白的家蚕杂交,通过对杂交后代眼部荧光筛选获得g RNA和Cas9双阳性家蚕。通过检测,我们发现双阳性家蚕的基因组中Bm Fox A基因与野生型相比发生了不同片段的缺失。进一步对双阳性个体后部丝腺中Bm Fox A蛋白的表达情况进行Western blotting检测。结果显示,与野生型相比,双阳性家蚕后部丝腺中Bm Fox A蛋白的表达量显著下调。结果表明我们成功获得了后部丝腺特异性敲除Bm Fox A的转基因家蚕,我们将其命名为Bm Fox A-PSG-M。2.后部丝腺特异性敲除Bm Fox A对丝腺发育的影响将Bm Fox A-PSG-M转基因家蚕作为材料,观察其丝腺的发育情况。与野生型家蚕的后部丝腺相比,Bm Fox A-PSG-M家蚕的后部丝腺发育异常,表现为后部丝腺缩短,呈现为念珠状,而非光滑的圆柱状。鬼笔环肽染色显示Bm Fox A-PSG-M家蚕的后部丝腺细胞更小,细胞排列杂乱,大小不均一,差异较大。DAPI染色显示,与野生型相比,Bm Fox A-PSG-M家蚕的后部丝腺细胞核核内复制能力较低。Bm Fox A-PSG-M家蚕后部丝腺的总DNA含量显著低于野生型家蚕。这些结果表明Bm Fox A参与了对家蚕后部丝腺的发育调控。3.后部丝腺特异性敲除Bm Fox A对家蚕蚕丝蛋白合成和分泌的影响由于Bm Fox A-PSG-M家蚕后部丝腺发育异常,可能会对家蚕的吐丝行为和经济性状产生影响。因此,我们观察了Bm Fox A-PSG-M家蚕的吐丝行为,检测了蚕丝蛋白中丝素丝胶的含量,并统计了蚕茧的经济性状。我们发现,部分Bm Fox A-PSG-M家蚕有吐丝动作,但不能正常吐出蚕丝,形成裸蛹;另一部分家蚕能够吐出蚕丝,形成较薄的蚕茧。与野生型蚕茧相比,Bm Fox A-PSG-M家蚕蚕茧中丝素含量显著降低,低于20%,蚕茧中丝胶含量较高。Bm Fox A-PSG-M家蚕的茧层重和茧层率显著降低。4.中部丝腺特异性敲除Bm Fox A对丝腺发育的影响我们将筛选到的Bm Fox A g RNA阳性个体与Ser1基因驱动表达的Cas9蛋白阳性个体杂交,经过荧光筛选获得了双阳性个体。Western blotting检测表明,与野生型相比,双阳性个体中部丝腺Bm Fox A蛋白表达水平显著降低,Bm Fox A被成功下调表达。我们将获得的转基因个体命名为Bm Fox A-MSG-M。鬼笔环肽染色发现,与野生型相比,Bm Fox A-MSG-M家蚕中部丝腺发育异常,其中部丝腺的后部明显缩短变细,细胞变小,大小不均一,排列杂乱。5.Bm Fox A调控丝腺发育机制初探我们推测Bm Fox A基因可能调控了家蚕丝腺细胞周期和细胞凋亡,进而影响了丝腺发育。在家蚕细胞中过表达Bm Fox A,发现与DNA复制相关的细胞周期因子Cyclin A、Cyclin D和Cyclin E均上调表达,细胞凋亡相关基因caspase1、caspase3、caspase4和caspase9的表达则受到抑制。因此我们猜测Bm Fox A可能通过促进丝腺细胞核内复制,同时抑制细胞凋亡来调控丝腺的发育。为进一步揭示Bm Fox A调控丝腺发育的分子机制,我们提取了五龄第三天野生型家蚕与Bm Fox A-PSG-M家蚕的后部丝腺RNA,对其进行转录组测序。q PCR证实转录组数据可靠。我们进一步对转录组数据进行差异基因分析,发现共有1117个差异表达基因,其中,在Bm Fox A-PSG-M家蚕中上调表达基因有1010个,下调基因107个。我们对差异基因进行了GO功能富集分析,发现GO功能主要富集在细胞膜组分、细胞粘附、脂质运输和糖脂代谢等方面,说明Bm Fox A基因参与调控了家蚕体内多种生理生化过程。我们对差异基因也进行了KEGG信号通路富集分析,发现主要富集在糖代谢相关通路,如糖酵解、丙酮酸代谢等。我们推测Bm Fox A可能通过参与糖代谢通路从而调控了丝腺细胞内DNA复制和丝腺细胞的发育。