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TDI-FP技术是一种全新的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)分析技术，它采用荧光偏振(Fluorescence Polarization，FP)为检测手段，是在TDI(Template-directed Dye-terminator Incorporation)法的基础上进一步发展和完善而成。TDI-FP技术具有非常高的特异性和敏感性，而且操作简便，可以实现SNP的自动化和高通量分析。 为了推广TDI-FP技术在我国SNP基础研究和临床疾病相关SNP或者点突变的检测中的应用，该课题利用TDI-FP技术建立了高通量单核苷酸多态性分析系统，并对HBV YMDD基序拉米夫定(LAM)耐药相关点突变进行检测来验正系统的准确性和可行性。 通过YMDD基序定点诱变质粒对高通量单核苷酸多态性分析系统的PCR反应体系和PCR产物消化时间进行优化。该系统的PCR反应体系为： 第四军医大学硕士学位论文总体积50pl，其中包括10x反应缓冲液5叶二5＊＊。卜L吨CI二3卜1、二．5卜＊。1／L＊＊＊＊2．＊1、25卜＊。儿引物＊ 和n各0．印I、hq＊＊A聚合酶（SU／pl）O．5“DNA 模板 … 和 ddHZO 37yi，使得 PCR 反应产物的浓度在1．18ng／卜l一7刀sng／卜1范困内。为了保证把 5卜IPCR产物中乘u余 dNTPs牙口弓物完全消化，最终确定至少于 3 7 C孵育 1刀h。 利用该系统对35例PCR阳性的HBV感染者血清进行检测，发现YMDD野生型26例、YVDD突变型2例、YVDD／YMDD突变混合型二例、YIDD突变型二例，YIDD／YMDD突变馄合型 1例，其中有两例在 74位 G，。；＋T的检测结果为阴性，经测序证明，其发生了C741突变型（YIDD）。把PCR产物与 pGEM丁 Easy载体重组进行测序结果与高通量单核昔酸多态性分析系统检测结果完全一致，特异性为 100％。山于该系统的敏感性与 PCR反应体系的敏感性直接相关，所以其敏感性为 92．l％。 山于TDI－FP技术具有非常高的特异性和敏感性，而且操作简便，可以实现自动化和高通量检测，因此其在研究病原微生物基因突变、人类基回组单核昔酸多态性、药物基因组学等方面具有广阔的应用前景。 为了实现高通量单核昔酸多态性分析系统对检测结果的自动化分析，我们以 Exel作表为依托，用 Visual Basic语言编写软件代码，开发了 HBV DNA突变高通量单核昔酸多态性分析系统检测软件。该软件主要针对HBV基因组四个开放读码框的主要点突变进行进行半自动化基因型分析，检测者可以根据样品的mP值和在散点图中分布，来分析其突变类型。该软件的设计为以后开发适用于人类单核昔酸多态性完全自动化分析研究软件“ SNP Scorer”打下了基础。