[研究背景]卵巢恶性肿瘤又称卵巢癌,是女性生殖器官常见的肿瘤之一。在妇女生殖系统肿瘤中,卵巢癌是死亡原因最高的一种肿瘤。卵巢癌初期一般无典型临床症状,难以及时发现及治疗,70%的患者就诊时已为晚期。迄今为止卵巢癌还无有效的治疗手段,临床上主要采用手术切除和放化疗联合治疗,且预后很差,5年生存率仅为30%。由于卵巢癌极高的恶性程度和死亡率,因此研究卵巢癌的恶性生物学行为及其发病机制就变的尤为重要。DNA的完整性及稳定性是保证细胞存活和维持正常生命活动的必要条件。细胞内代谢产物及化疗药物、电离辐射等多种因素都能导致DNA发生不同形式的损伤,其中DNA双链断裂(DNA double-strand breaks, DSBs)和DNA链间交联(interstrand crosslinks, ICLs)是最严重的损伤形式,可导致细胞死亡或衰老,也是放疗和某些化疗药物的主要作用机制。当DNA受到双链断裂损伤时,细胞主要启动同源重组修复(Homologous recombination repair,HRR)和非同源末端连接修复(Non-homologous end joining, NHEJ)对损伤进行修复。通过同源重组修复,受损伤的染色单体可以利用和自身相似而完整的另一条姐妹染色单体对自身进行修复。真核生物中的RAD51蛋白是执行同源重组修复的重组酶。众多研究显示RAD51在多种肿瘤中高表达并赋予癌细胞对放化疗的耐受性。自由基是细胞内不可缺少的一种活性物质。正常情况下,细胞内都存在套完整的抗氧化系统,可以维持自由基的代谢平衡。可是当细胞受到物理、化学等有害刺激时,体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species, RNS)产生过多,使得细胞内抗氧化物的清除速度落后于胞内氧化物质的产生速度,氧化系统和抗氧化系统失衡,就会导致细胞发生损伤,其中包括DNA氧化损伤。可以预期,RAD51的高表达会使细胞修复外界损伤的能力增强,从而更好地保护细胞生存及进行正常的生命活动。RAD51在多种肿瘤中高表达并与肿瘤恶性程度呈正相关。除了通过经典的HR修复功能提高细胞对DNA损伤的修复能力,RAD51是否还能通过其他机制帮助癌细胞耐受各种压力呢?本课题探讨了RAD51在应对氧化压力中的作用。我们利用实验室前期构建稳筛获得的RAD51过表达的细胞系(A2780-mRAD51和A 2780-pcDNA3.1),通过药物处理对细胞造成氧化压力,结果发现RAD51过表达的细胞与对照细胞相比可以有效的进行DNA损伤的修复,减少DNA双链断裂的形成；同时可以有效的降低细胞的ROS水平,使细胞更好地存活。同时还发现当降低细胞内RAD51的表达水平时,会对细胞产生增殖障碍,产生更多的DNA损伤,而这种增殖障碍是由于RAD51的缺陷导致细胞内ROS水平升高所引起的。此外还发现RAD51缺失后NRF2通路的相关靶基因也出现一定程度的下调,这就提示我们RAD51缺失导致ROS水平升高部分是由NRF2通路介导的。说明RAD51主要是通过增强DNA损伤修复能力以及自身抗氧化压力的功能来发挥对肿瘤细胞生存的保护作用。[研究目的]研究RAD51在卵巢癌细胞耐受氧化压力中的作用及其机制。[研究方法]一、利用平板克隆形成实验检测H202对RAD51过表达细胞(A2780-mRAD51)和对照细胞(A2780-pcDNA3.1)的生存影响。二、利用流式细胞术检测H202处理RAD51过表达细胞(A2780-mRAD51)和对照细胞(A2780-pcDNA3.1)24小时后ROS水平的变化。三、利用免疫荧光方法检测H2O2/TH287处理24小时后,RAD51过表达细胞(A2780-mRAD51)和对照细胞(A2780-pcDNA3.1)中DNA双链断裂标记γ-H2AX焦点的形成情况。四、利用流式细胞术和免疫荧光方法检测RAD51缺失细胞中ROS水平的变化情况。五、利用免疫荧光方法检测RAD51缺失细胞中8-OHdG的形成情况。六、利用平板克隆形成实验和EdU掺入实验检测siRAD51和NAC单独和联合处理对卵巢癌细胞生长的作用。七、利用Real-time PCR技术检测RAD51缺失细胞中抗氧化相关基因NRF2及其靶基因NQO1、HO-1等的表达。[实验结果]一、H2O2对A2780-pcDNA3.1的细胞生长具有明显的抑制作用,而对A2780-mRAD51的细胞影响较小,表明RAD51过表达帮助细胞耐受氧化压力。二、H202可以显著升高A2780-pcDNA31细胞的ROS水平,而对A2780-mRAD51细胞中ROS水平影响较小。三、H202处理后,A2780-pcDNA3.1细胞中DNA损伤明显增加,而A2780-mRAD51的细胞中DNA损伤水平较低。四、免疫荧光实验和流式细胞术均表明IRAD51的缺失可以显著增加细胞内ROS的水平。五、免疫荧光实验发现RAD51的缺失可以造成8-OHdG的大量产生,说明细胞内的氧化压力导致了DNA碱基损伤。六、抗氧化物NAC处理siRAD51的卵巢癌细胞A2780、H08910,可以明显拯救细胞的增殖障碍,说明RAD51缺失对细胞产生的增殖抑制作用是部分通过ROS介导的。七、RAD51缺失的肿瘤细胞中,NRF2及其靶基因NQO1、HO-1水平下调。[结论]除了执行HR修复的经典功能,RAD51还可通过降低细胞内ROS水平来增强细胞对氧化压力的耐受性。