论文部分内容阅读
NLRP3炎症小体作为重要的模式识别受体,不仅能介导巨噬细胞炎症因子的分泌,同时也参与调控细胞的炎性焦亡,其在非免疫细胞如肿瘤细胞中的作用尚不明确。本文主要围绕NLRP3炎症小体复合物在结肠癌细胞中的功能及其活化调控展开研究,以期揭示NLRP3炎症小体对结肠癌发生发展及化疗耐药的影响并找到以此为靶点的结肠癌治疗候选化合物。 在第一章中我们首先叙述了NLRP3炎症小体的组成及结构,并对其活化调控机制进行了归纳,进一步介绍了已有关于NLRP3炎症小体在肿瘤形成与发展过程中作用的研究;然后,我们对癌症及结肠癌的形成机制和治疗进展做了综述。通过这样的综述,为后三章的研究提供理论依据。 在第二章的研究中,我们发现结肠癌细胞HT29和SW480表达NLRP3炎症小体复合物的各组分,并且NLRP3/ASC/pro-caspase-1(pro-CASP-1)三者组装形成复合物。通常情况下,NLRP3/ASC/CASP-1形成复合物后会介导CASP-1的自剪切活化,然而有趣的是HT29细胞中虽然存在NLRP3/ASC/CASP-1复合物,但却检测不到活化形式的CASP-1,同时HT29细胞并不表达pro-IL-1β,也不分泌IL-1β。我们进一步发现Nigericin能够诱导HT29细胞发生依赖于CASP-1的炎性焦亡,并且此过程中无IL-1β的释放。以上结果提示我们:结肠癌细胞HT29中NLRP3炎症小体各组分表达并且静息状态下便组装形成复合物,但NLRP3/ASC/CASP-1复合物组装但非活化的详细机制尚不明确。 为了探讨NLRP3/ASC/CASP-1复合物在HT29细胞中非活化组装的机制,在第三章中我们利用免疫共沉淀的方法,发现了能够与复合物结合的分子—嘌呤霉素敏感的氨肽酶PSAP (Puromycin sensitive aminopeptidase)。通过免疫共沉淀实验的分析,PSAP不与ASC及CASP-1结合,而与NLRP3直接结合。通过结构域结合的分析证实PSAP酶活区域与NLRP3的NACHT和LRR的结构域发生相互作用。PSAP敲低或者酶活抑制均能促进CASP-1的活化,诱导HT29细胞发生炎性焦亡。 在本文的第四章我们发现,PSAP过表达能够促进HT29细胞的增殖及裸鼠移植瘤的生长。然而,与肿瘤细胞相比,正常的肠上皮细胞株中PSAP-NLRP3炎症小体复合物并不存在。我们进一步构建了AOM+DSS诱导的炎癌转化模型,分离不同阶段小鼠结肠上皮细胞及结肠癌组织,发现PSAP-NLRP3炎症小体复合物是随着肿瘤发生的进程而逐渐形成的。这也证明此PSAP-NLRP3炎症小体复合物的形成利于肿瘤细胞的生存。同时,我们检测了临床结肠癌样本中PSAP的表达情况,比较了正常组织和结肠癌组织中PSAP的表达情况,发现无论是蛋白还是mRNA水平,PSAP的表达都显著升高。进一步,我们收集了临床上经5-FU治疗的33例结肠癌患者的组织样本,免疫组化评分结果显示,PSAP的表达与5-FU治疗的结肠癌患者的无进展生存期(PFS)呈负相关。细胞水平的研究结果也显示PSAP的过表达能够促进HT29细胞对5-FU的耐药。结肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤,相较于其他肿瘤,结肠癌本身对化疗的耐药性较高。研究发现,与其他结肠癌细胞相比HT29细胞对5-FU等原发耐药,我们用NLRP3炎症小体活化诱导剂Nigericin与5-FU联合使用,发现Nigericin能够促进5-FU对HT29细胞的抑制作用。同时,通过PSAP敲低或PSAP的酶活抑制诱导炎症小体活化,也能够增强HT29细胞对5-FU的敏感性,提示HT29细胞中5-FU耐药与PSAP/NLRP3/ASC/CASP-1复合物组装非活化有关。以上结果提示我们PSAP-NLRP3炎症小体复合物参与结肠癌的形成,其组装非活化可能参与结肠癌的化疗耐药,可能成为结肠癌治疗的靶点。 在论文的最后一章,我们探讨了以PSAP-NLRP3炎症小体复合物为作用环节的抗肿瘤策略,以期发现能抑制结肠癌增殖及逆转其5-FU耐药的候选化合物。首先我们利用PSAP稳定敲低的HT29细胞构建裸鼠移植瘤模型,证实PSAP敲低的肿瘤生长速度明显下降。PSAP的抑制剂PAQ-22同样能够抑制肿瘤的生长。此外,我们采用LPS+ATP诱导的NLRP3炎症小体活化模型,筛选到了能显著促进IL-1β释放的化合物AI-34。AI-34处理能够促进CASP-1活化,继而切割GSDMD,诱导HT29细胞发生炎性焦亡,并促进HT29细胞对5-FU的敏感性;动物实验同样显示AI-34给药能够抑制肿瘤的生长。有趣的是我们发现AI-34促进HT29细胞中CASP-1活化的机制与其降低PSAP的表达水平有关。AI-34的处理不影响PSAP的mRNA表达,但是能够促进PSAP发生自噬溶酶体途径介导的降解。当PSAP被降解后,NLRP3炎症小体复合物的抑制解除,CASP-1活化,ASC恢复功能,二者共同促进肿瘤细胞死亡。以上结果提示通过小分子化合物诱导肿瘤细胞中NLRP3炎症小体活化可实现结肠癌的抑制及化疗耐药的逆转。 综上所述,本论文发现并证实了PSAP-NLRP3炎症小体复合物在结肠癌的形成、调控及其在化疗耐药中的重要作用,证明了以此为作用环节可实现结肠癌的抑制及化疗耐药的逆转,并筛选到了相关的小分子化合物。本论文的研究丰富了NLRP3炎症小体的调控机制,揭示了其在非免疫细胞中的新功能,从不同于以往的视角提出了逆转结肠癌化疗耐药的新机制,为新型抗结肠癌药物的研发提供了新的策略,对临床结肠癌的治疗提供了有益的指导。