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目的:本研究通过建立真实环境PM2.5暴露模型,探索PM2.5致肺纤维化的关键靶点和潜在致病机制。方法:72只雄性C57BL/6小鼠随机分为洁净组（Filtered air,FA）、大气组（Unfiltered air,UA）和PM2.5浓缩组(Concentrated PM2.5 air,CA),每组12只,每天暴露6小时,每周7天,持续暴露时间分别为8周和16周。24只雄性野生型（Wild type,WT）小鼠和24只ALKBH5基因敲除小鼠(ALKBH5-/-,KO)各随机分为洁净组（FA）和PM2.5浓缩组（CA）,分别命名为WT-FA、WT-CA、KO-FA和KO-CA,持续暴露时间为8周（6h/天,7d/周）。使用空气动力学粒径谱仪和气溶胶颗粒物检测仪分别检测各暴露腔内颗粒物的粒径分布以及PM2.5的浓度。监测各组温湿度。同一时间,设置智能大流量空气颗粒物采样器进行PM2.5颗粒物的采集。将采集到的PM2.5颗粒物标本通过超声,冻干和溶解后制备成20mg/ml的PM2.5原液于-80℃储存。PM2.5暴露结束后,采用HE、Masson染色检测小鼠肺组织病理结构与胶原纤维沉积水平;肺功能仪检测小鼠限制性通气功能,q PCR和western blot分别检测细胞外基质（extracellular matrix,ECM）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、Yes相关蛋白1（Yes-associated protein 1,YAP1）,PDZ结合位点的转录共激活因子（PDZ-binding motif,TAZ）,脯氨酰4-羟化酶α2亚基（Prolyl-4-hydroxylase A subunit 2,P4HA2）,Alk B家族蛋白5（Alk B homolog 5,ALKBH5）以及三基序蛋白11（Tripartite Motif Containing 11,TRIM11）的水平;使用Target Scan和miRDB数据库预测靶向YAP1-mRNA的miRNAs,并通过q PCR检测小鼠肺组织内miRNAs（miRNA-21a-5p、miRNA-590-5p、miRNA-361-3p、miRNA-202-3p）的水平。在体外实验中,将PM2.5原液使用DMEM培养基（Dulbecco’s modified eagle media）配置成不同浓度的PM2.5（25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml）应用液处理NIH/3T3细胞系24小时后,使用q PCR和western blot分别检测ECM、α-SMA、YAP1、TAZ、P4HA2、ALKBH5、TRIM11水平。在NIH/3T3细胞中,用5μMshTRIM11质粒或si ALKBH5转染24h,构建TRIM11和ALKBH5低表达细胞株,分别命名为shTRIM11,si ALKBH5细胞系。使用si ALKBH5与miRNA mimics（miRNA-21a-5p、miRNA-590-5p、miRNA-361-3p、miRNA-202-3p）共转染NIH/3T3细胞系24h,使用q PCR检测YAP1-mRNA水平,用以探讨ALKBH5对YAP1信号通路的调控作用;免疫荧光验证TRIM11和ALKBH5在小鼠肺组织中的共定位情况,免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP）实验用于检测TRIM11和ALKBH5的直接结合作用;使用10μM、20μM蛋白酶体抑制剂（MG132）处理NIH/3T3细胞系24h后,使用western blot检测ALKBH5蛋白,用于探讨ALKBH5蛋白降解途径;20μM MG132与shTRIM11共同处理NIH/3T3细胞24h,使用western blot检测ALKBH5蛋白,用于探讨ALKBH5蛋白降解原因。结果:1.暴露腔内PM2.5浓度、颗粒物的粒径分布及温湿度在整个暴露期间,暴露8周的FA、UA、CA组的PM2.5 24 h平均浓度分别为0、23.71和225.05μg/m~3,暴露16周的FA、UA、CA组的PM2.524小时平均浓度分别0、21.75和168.00μg/m~3。暴露8周的WT和ALKBH5-/-FA、CA组PM2.5 24小时平均浓度分别为0和225.05μg/m~3。暴露期间腔室中的粒度分布情况为,FA、UA、CA腔内小于2.5μm的颗粒物分别占0,90.46%和99.48%。FA、UA、CA腔的平均温度分别为22.89℃、21.65℃和22.24℃;平均湿度分别是45.96%RH、46.02%RH和47.24%RH。2.PM2.5暴露导致小鼠肺功能下降肺功能所有指标在暴露8周和16周均呈下降趋势。对于暴露8周的小鼠,CA组小鼠深吸气量（Inspiratory capacity,IC）、肺活量（Vital capacity,VC）、肺顺应性（Lung compliance,C chord）较FA组小鼠均显著降低（P＜0.05）。对于暴露16周的小鼠,与FA组小鼠相比,CA组小鼠除用力肺活量（Forced vital capacity,FVC）、IC外其他指标均显著降低（P＜0.05）。暴露16周后的CA组小鼠功能残气量（Functional residual capacity,FRC）和C chord显著低于暴露8周CA组小鼠（P＜0.05）。3.PM2.5暴露引起小鼠肺组织的形态学改变通过HE染色观察到小鼠暴露PM2.5后,随暴露浓度的增加和暴露时间的延长,小鼠肺组织内出现肺泡间隔增厚,支气管上皮细胞不典型增生以及炎症细胞浸润;Masson染色结果发现,UA和CA组的小鼠肺组织内出现胶原沉积,定量分析结果显示,暴露16周后CA组小鼠肺组织中的胶原面积较8周相比显著增加（P＜0.05）。4.PM2.5暴露促进细胞外基质沉积及α-SMA表达增加随着PM2.5暴露浓度增加和暴露时间的延长,小鼠肺组织细胞外基质（ECM）主要成分1型胶原蛋白（collagenΙ）和3型胶原蛋白（collagenШ）,纤维连接蛋白（Fibronectin-1,Fn-1）的水平增加（P＜0.05）;与FA组相比,UA和CA组小鼠肺组织中α-SMA的水平显著增加（P＜0.05）;在体外实验中,使用不同浓度PM2.5（25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml）处理NIH/3T3细胞系24小时后,collagen I、collagen III、Fn1和α-SMA的水平随PM2.5浓度增加而增加（P＜0.05）。5.PM2.5暴露引起ALKBH5蛋白降解及YAP1/TAZ/P4HA2信号激活随着PM2.5暴露时间的延长和暴露浓度的增加,小鼠肺组织中ALKBH5蛋白水平逐渐降低（P＜0.05）。与FA组相比,暴露16周的UA或CA组小鼠肺组织中YAP1蛋白的表达明显高于暴露8周（P＜0.05）。与暴露8周的CA组小鼠相比,暴露16周的CA组小鼠肺组织中TAZ蛋白水平显著升高（P＜0.05）。CA或UA组小鼠暴露16周后肺组织中P4HA2蛋白水平显著高于暴露8周（P＜0.05）。YAP1-mRNA的表达与蛋白质有相似的变化。体外实验结果显示,PM2.5暴露后,ALKBH5蛋白水平随PM2.5处理浓度的增加逐渐下降,YAP1、TAZ和P4HA2蛋白和YAP1-mRNA水平随PM2.5浓度增加逐渐升高（P＜0.05）。6.ALKBH5缺失加重PM2.5导致的小鼠肺功能下降在PM2.5暴露后,与KO-FA组小鼠相比,KO-CA组小鼠肺功能的所有指标均显著降低（P＜0.05）。然而,与WT-FA组小鼠相比,WT-CA小鼠中只有IC和C chord显著降低（P＜0.05）。此外,KO-CA组小鼠的FVC、FRC和VC比WT-CA组小鼠分别降低了19.0%、12.8%、13.9%（P＜0.05）。7.ALKBH5缺乏促进PM2.5暴露导致的“YAP1/TAZ/P4HA2”信号通路的激活和肺内ECM沉积HE染色结果显示,与WT-CA组小鼠相比,KO-CA组小鼠肺组织中出现更多的炎症细胞和更严重的肺泡间隔增厚、支气管上皮不典型的增生。Masson染色结果显示,KO-CA组小鼠肺组织中胶原面积比WT-CA组小鼠增加1.4倍（P＜0.05）。WT-CA和KO-CA小鼠肺组织中的collagen I、collagen III和Fn1-mRNA水平显著高于相应的FA组（P＜0.05）。与WT-CA小鼠相比,KO-CA小鼠肺组织中的collagen I-mRNA,collagenⅢ-mRNA和Fn1-mRNA分别增加了1.3、1.7和2.3倍（P＜0.05）,α-SMA蛋白水平增加1.2倍（P＜0.05）,YAP1、TAZ、P4HA2蛋白水平分别增加1.5、1.2、1.2倍（P＜0.05）,YAP1-mRNA水平增加2.3倍（P＜0.05）。8.ALKBH5缺乏通过降低靶向YAP1-mRNA的miRNAs的水平促进YAP1信号通路的激活KO-CA小鼠肺组织中miRNA-21a-5p、miRNA-590-5p、miRNA-361-3p、miRNA-202-3p的水平与WT-CA小鼠相比,分别降低了58%、50%、42%、23%（P＜0.05）。挽救实验结果显示,miRNA mimics有效地逆转了受si ALKBH5影响的YAP1-mRNA的水平。9.ALKBH5被TRIM11识别并通过蛋白酶体途径降解使用MG132处理NIH/3T3细胞系24h后,与0μM MG132组相比,10μM MG132和20μM MG132组的ALKBH5蛋白的降解被抑制。与NC+PM2.5组相比,MG132+PM2.5组ALKBH5蛋白水平增加2.1倍（P＜0.05）。与FA和UA组小鼠相比,在PM2.5暴露8周和16周后CA组小鼠肺组织中的TRIM11蛋白水平显著升高（P＜0.05）。与暴露8周的CA组小鼠相比,暴露16周的CA组小鼠肺组织内TRIM11蛋白水平明显增加（P＜0.05）。TRIM11-mRNA水平变化与蛋白水平变化一致。在NIH/3T3细胞中,TRIM11蛋白的水平随PM2.5浓度的剂量增加而增加（P＜0.05）。通过生物信息学网站Ubibrowser预测结果显示ALKBH5是TRIM11的潜在底物。免疫荧光结果显示TRIM11与ALKBH5蛋白在小鼠肺组织中共定位,TRIM11或ALKBH5的平均光密度变化趋势与肺组织内ALKBH5和TRIM11蛋白水平变化一致。CO-IP结果证实了TRIM11和ALKBH5之间具有直接的相互作用。与NC+PM2.5组相比,shTRIM11+PM2.5组的ALKBH5蛋白水平增加了1.8倍（P＜0.05）。与NC+MG132组相比,shTRIM11+MG132组的ALKBH5蛋白水平升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。上述结果表明PM2.5暴露后促进ALKBH5以依赖TRIM11的方式通过蛋白酶体途径降解。结论:1.PM2.5暴露后可以导致小鼠肺功能的下降;PM2.5暴露促进ECM的沉积并最终导致肺纤维化。2.PM2.5暴露通过影响靶向YAP1-mRNA的miRNAs水平下降,激活YAP1信号通路,促进ECM的沉积。3.靶向YAP1-mRNA的miRNAs水平受ALKBH5调控。4.PM2.5暴露促进ALKBH5以依赖TRIM11的方式通过蛋白酶体途径降解。