阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）又称老年性痴呆，是一种以临床表现为进行性认知功能障碍、记忆力及生活能力减退为主的神经系统退行性疾病。尽管AD发病机制目前还不十分明确，但β淀粉样蛋白（amyloid beta-protein,Aβ）作为AD发病的始动因子已得到广泛认可。目前对Aβ引起AD的机制研究主要集中在炎症反应、神经元凋亡及氧化应激。自1970年以来，人们逐渐发现小胶质细胞（microglia,MG）是中枢神经系统的免疫效应细胞，在机体固有免疫及多种神经退行性疾病的炎症反应中承担重要作用。近年来相关研究表明，MG在AD神经病理变化中起着“双刃剑”的作用。一方面，活化的MG可以通过吞噬作用清除β淀粉样蛋白,从而降低Aβ对神经元的毒性作用；另一方面，过度活化的MG可产生大量的炎性介质，如IL-1β、TNF-α等，这些炎性介质诱导慢性炎症反应的形成，进而加速AD病程的发展和恶化。因此，本课题从整体动物实验动态观察大鼠海马注射Aβ不同时间段后神经元损伤情况、Aβ沉积量及MG活化量，着重分析Aβ沉积、神经元损伤与MG的激活三者之间的关系;另有研究表明，Aβ通过加重大鼠海马神经元凋亡诱发神经毒性作用，Aβ对在体及体外的神经细胞的毒性作用依赖于其聚集状态与浓度，为进一步分析其作用机制，本课题离体实验进行体外PC12细胞培养,经不同浓度凝聚态Aβ处理后，采用MTT、Hoechst33258染色、免疫细胞化学及免疫印迹方法，比较分析Aβ对PC12细胞凋亡相关蛋白表达的影响。第一部分β淀粉样蛋白对大鼠海马神经元及小胶质细胞的影响目的：探讨双侧海马注射Aβ25-35后不同时间点对大鼠海马神经元及小胶质细胞的影响，分析Aβ对神经元的作用、Aβ沉积和MG激活的关系。方法：1实验分组及处理：实验分为正常对照组和Aβ处理组（4个时间点），每组8只，适应性饲养一周。正常对照组注射无菌生理盐水5μl, Aβ处理组注射凝聚态Aβ25-355μl(10μg)。Aβ处理组按照注射Aβ25-35后不同时间2、7、15、21天处死分为4组。2AD模型制备：海马区定位坐标：AP-3.5mm，ML±2.0mm，DV2.7mm。双侧用微量注射器分别注入5μl凝聚态Aβ25-3510min注完，留针5min。3Morris水迷宫行为学实验:水池注水至水面高于平台1.5cm，维持水温（21±1）℃，加入墨汁搅匀，确保大鼠不会看见平台；实验期间迷宫周围参照物不变，自动摄像机同步记录大鼠运动轨迹。注射Aβ7天后开始实验，第1-2天为训练，第3-5天数据作为学习、记忆成绩，第6天撤去平台，观察大鼠2分钟内穿越平台区域的次数。4标本处理:大鼠麻醉灌注后，取脑组织固定24h后石蜡包埋，行冠状切片，5μm厚，含海马部位，以备进行硫堇染色和Aβ、CD11b（染MG）免疫组化。5统计学处理:采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。结果：1Aβ对大鼠水迷宫实验的影响：对照组大鼠第3，4，5天寻找平台的潜伏期分别为13.57，8.68，7.09秒，15天和21天Aβ处理组大鼠3天的潜伏期明显比对照组长（P<0.05）。对照组大鼠2分钟内穿越平台次数为11.13次，15天和21天Aβ处理组大鼠穿越平台次数为分别为4.25、4.38次，较对照组明显减少（P<0.05）。2Aβ对大鼠海马神经元的影响:硫堇染色显示，对照组大鼠海马CA1区细胞带完整，细胞排列整齐有序，细胞形态正常，胞核不着色，胞浆尼氏体着色深，未见神经元缺失和胶质细胞增生。Aβ处理组大鼠从注射Aβ2天至7天、15天细胞损伤逐渐加重，胶质细胞增多，至21天，细胞损伤较15天有缓和现象，胶质细胞减少。3海马CA1区Aβ25-35沉积和MG的变化Aβ免疫组化显示模型组大鼠Aβ沉积量在2-7天稳定并达最高值，之后呈下降趋势。CD11b免疫组化显示，MG分布部位与Aβ沉积部位相似。与对照组相比，Aβ处理组4个时间点MG的形态和活化量都有显著差异（P<0.05），Aβ处理组2天和7天MG活化量达最多，两组无显著差异（P>0.05），但其后MG活化量随时间延长呈下降趋势。结论：Aβ可以引起神经元损伤，降低大鼠的学习记忆能力；Aβ可以激活MG，引起MG形态和数量改变,募集活化的MG到Aβ沉积部位，MG可吞噬、清除Aβ；Aβ沉积量和MG活化数量变化呈正相关。第二部分Aβ25-35对PC12细胞凋亡相关蛋白表达的影响目的：观察不同浓度(0.1、1、2、5、10、20μmol/L)Aβ25-35对PC12细胞凋亡相关蛋白表达的影响。方法：采用不同浓度的Aβ25-35与PC12细胞共孵育48h后, MTT法检测细胞生长活性， Hoechst33258核染色形态学检测细胞凋亡，免疫细胞化学及免疫印迹检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,Caspase-3表达。结果：MTT检测显示Aβ25-35抑制细胞生长活性呈浓度依赖性，Aβ25-35对PC12细胞体外培养生长活性抑制作用随Aβ25-35浓度的增大而加强；Hoechst33258染色显示Aβ25-35与PC12细胞凋亡呈浓度依赖性关系；免疫细胞化学及免疫印迹检测结果均显示Bcl-2蛋白表达量随Aβ25-35浓度的增大呈下降趋势，Bax,Caspase-3蛋白表达量随Aβ25-35浓度的增大呈上升趋势。结论：Aβ25-35可致PC12细胞凋亡，其机制与下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，上调促凋亡蛋白Bax,Caspase-3表达有关。