研究背景:近年来,人类的预期寿命显著增加,但男性精液质量却呈不断下降趋势。环境暴露是引起精液质量下降的主要原因之一。已证实以邻苯二甲酸二丁酯（DBP）为代表的邻苯二甲酸酯类化合物具有明显的雄性生殖毒性,可导致睾丸生殖细胞凋亡、睾酮合成紊乱、生精细胞脱落、精液质量下降等。在雄性生殖系统中,睾丸支持细胞对生精过程至关重要,作为DBP发挥生殖毒性的重要靶细胞之一,其结构和功能的异常可导致以生精细胞脱落为代表的生精过程异常,但具体的作用机制尚未完全清楚。支持细胞内主要的中间纤维是波形蛋白,处于正常聚合和解聚动态平衡状态的波形蛋白对于维持睾丸支持细胞的正常结构具有重要作用。我们前期研究发现:DBP暴露可通过诱导波形蛋白异常解聚从而使睾丸支持细胞失去结构支撑,进而向基底层塌陷并最终导致生精细胞脱落。通过对波形蛋白的调控进行生物信息学分析发现波形蛋白启动子区存在多个Sox30的结合位点。Sox30基因是1999年新发现的一个基因,是Sox基因家族H亚族的仅有成员,目前已经证实Sox30在睾丸发育中高表达并且对于生精过程是必须的,但是其在生殖发育中的具体作用及机制还不太清楚。同时前期通过组学筛选及分析发现Sox30基因是DBP暴露的应答分子之一。因此,研究DBP应答基因Sox30在生精细胞脱落中的作用及机制,可为探究环境暴露导致的男性精液质量持续下降提供新的实验证据。研究目的:进一步证实DBP应答基因Sox30在生精细胞脱落中的作用;明确Sox30调控生精细胞脱落的分子机制。研究方法:1.利用JASPAR网站对波形蛋白启动子区结合位点进行预测分析。在前期构建的DBP染毒大鼠原代睾丸支持细胞中利用q RT-PCR法及Western blotting法在m RNA以及蛋白水平检测Sox30基因以及波形蛋白的表达。体外构建小鼠支持细胞株（TM4）细胞DBP染毒模型,采用免疫荧光法对DBP染毒后的TM4细胞骨架结构进行染色。探究DBP对支持细胞骨架系统以及Sox30表达的影响。2.采用慢病毒载体在TM4细胞中构建Sox30过表达模型以及si RNA技术构建Sox30干扰TM4细胞模型。观察Sox30差异表达后对TM4细胞形态的影响;利用q RT-PCR法和Western blotting法检测Sox30差异表达后TM4细胞波形蛋白的表达水平、波形蛋白磷酸化水平,体外评价Sox30对TM4细胞骨架关键分子波形蛋白的影响。3.基于Sox30基因敲除小鼠模型,计算Sox30+/+（Sox30野生型）、Sox30-/+（Sox30杂合型）、Sox30-/-（Sox30纯合缺失型）三种基因型小鼠的睾丸脏器指数;通过HE染色后光学显微镜观察比较不同基因型小鼠睾丸及附睾的病理形态,分析Sox30敲除对睾丸曲细精管中支持细胞及各级生精细胞的影响;免疫荧光法检测和分析不同基因型小鼠睾丸支持细胞骨架结构;采用q RT-PCR和Western blotting法检测不同基因型小鼠睾丸组织中波形蛋白的表达水平和波形蛋白的磷酸化水平。在体内模型中评价Sox30在支持细胞骨架系统维持中的作用以及对波形蛋白表达和磷酸化的影响,明确Sox30敲除在生精细胞的脱落中的作用。4.通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）和UCSC（http://genome.ucsc.ed u/cgi-bin/hg Blat）寻找波形蛋白基因的启动子区,设计引物PCR扩增后克隆至荧光素酶报告载体,与Sox30过表达载体/Vector及p RL-TK质粒共转染至TM4细胞,采用荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光素酶活性变化,确定Sox30是否能够调控波形蛋白启动子活性,明确Sox30对波形蛋白的转录调控作用。5.在构建的Sox30过表达细胞模型和Sox30干扰细胞模型基础上,采用q RT-PCR和Western blotting法初步筛选出Sox30调控波形蛋白磷酸化的关键中间分子;在此基础上,采用相关分子的激动剂和抑制剂对Sox30过表达细胞或Sox30干扰细胞进行处理,检测波形蛋白的表达、磷酸化水平以及波形蛋白骨架系统的恢复情况,体外确定参与Sox30调控波形蛋白磷酸化的靶分子。另外,通过Western blotting法检测Sox30+/+、Sox30-/+、Sox30-/-三种基因型小鼠睾丸组织中相关靶分子的蛋白表达水平,在体内敲除小鼠模型中进一步探索哪些磷酸激酶在Sox30诱导的波形蛋白的磷酸化中起关键作用。研究结果:1.DBP暴露可诱导支持细胞骨架系统解聚及Sox30异常表达课题组前期研究结果表明DBP处理大鼠睾丸支持细胞后会导致波形蛋白骨架发生解聚且诱导生精细胞脱落,为了进一步探究其分子机制,我们利用JASPAR网站分析发现波形蛋白的启动子区存在多个Sox30的结合位点,表明Sox30可能参与支持细胞波形蛋白的调控。100μM DBP处理后大鼠原代睾丸支持细胞中Sox30基因的表达水平显著下调,而波形蛋白的表达及磷酸化水平呈上升趋势（P＜0.05）。DBP暴露48h后50μM、100μM以及200μM DBP染毒组TM4细胞较溶剂对照组数目明显减少,CCK8检测结果显示DBP处理可明显抑制TM4细胞的增殖,呈明显的剂量效应关系;免疫荧光结果显示100μM DBP处理后TM4细胞波形蛋白细胞骨架发生解聚。以上结果表明Sox30是DBP的应答分子,并且可能与DBP诱导的波形蛋白骨架系统解聚相关。2.Sox30基因敲除导致小鼠睾丸生精细胞脱落以及支持细胞波形蛋白骨架系统解聚（1）体外研究:在TM4细胞中成功构建Sox30过表达模型后,我们对波形蛋白的m RNA水平和蛋白表达水平以及波形蛋白的磷酸化水平进行了检测,结果显示Sox30过表达可导致TM4细胞波形蛋白表达水平及磷酸化水平明显降低。同时,在TM4细胞中成功构建了Sox30干扰体外模型,并检测了波形蛋白的表达水平以及磷酸化水平。结果显示干扰Sox30后TM4细胞中波形蛋白的m RNA水平及蛋白表达水平均显著增加（P＜0.05）,同时波形蛋白的磷酸化水平也显著增加。以上结果在体外细胞模型中证实了Sox30对TM4细胞波形蛋白骨架系统的调控作用。（2）体内研究:利用前期构建好的Sox30敲除小鼠模型,通过PCR鉴定获得基因型为Sox30+/+、Sox30-/+、Sox30-/-的实验用小鼠。我们发现Sox30-/-型小鼠的睾丸重量及脏器指数较Sox30+/+型及Sox30-/+型显著下降（P＜0.05）。HE染色结果发现Sox30-/-型小鼠睾丸曲细精管中可见分裂异常的巨细胞,大量生精细胞排列紊乱、脱落,管腔中及附睾中未见长形精子。对Sox30-/-小鼠睾丸组织中的波形蛋白进行免疫荧光染色后,发现Sox30-/-睾丸中的波形蛋白的细胞骨架变得松散塌陷,并且其向管腔延伸的部分变短并有空泡化现象。同时,Sox30-/-型小鼠中波形蛋白的表达水平及磷酸化水平显著上调。这些结果在体内敲除小鼠模型中证实了Sox30在波形蛋白骨架解聚中的作用,提示Sox30基因可能通过调控波形蛋白的表达及磷酸化导致小鼠生精细胞脱落。3.Sox30可在转录水平直接调控波形蛋白的表达并通过ERK1/2通路影响波形蛋白的磷酸化（1）Sox30对波形蛋白的转录调控:将设计的波形蛋白启动子区荧光素酶报告载体和Sox30过表达载体/Vector以及p RL-TK质粒共转染至TM4细胞后孵育36h,与空载组相比,Sox30过表达细胞中的相对荧光强度显著降低,表明Sox30能够调控波形蛋白启动子活性,提示Sox30可以在转录水平调控波形蛋白的表达。（2）Sox30对波形蛋白磷酸化的研究:在前期构建的Sox30过表达细胞模型和Sox30干扰细胞模型的基础上对参与波形蛋白解聚的蛋白激酶进行了初步筛选,我们发现在Sox30过表达细胞模型中,ERK1/2表达以及p-ERK1/2磷酸化水平降低,而干扰Sox30后TM4细胞中ERK1/2的表达及p-ERK1/2磷酸化水平则明显升高,提示ERK1/2可能是Sox30调控波形蛋白磷酸化的关键候选分子。在此基础上,我们使用ERK1/2的激动剂（Bortezomib）处理Sox30过表达细胞,抑制剂（SCH772984）处理Sox30干扰细胞,并检测波形蛋白的磷酸化水平。结果发现ERK1/2激动剂可以明显增强波形蛋白的磷酸化程度,而抑制剂的结果则正好相反,抑制了波形蛋白的表达水平以及磷酸化水平。另一方面,体内研究结果也证实Sox30敲除可导致小鼠睾丸组织中ERK1/2的表达及其磷酸化水平显著升高。以上体内外的研究结果表明ERK1/2是Sox30与波形蛋白磷酸化之间的关键信号分子,Sox30可通过ERK1/2在蛋白水平调控波形蛋白的磷酸化。结论:1.Sox30基因在DBP致小鼠睾丸生精细胞脱落中发挥重要作用。2.Sox30基因可通过影响支持细胞波形蛋白骨架系统调控睾丸生精细胞脱落。3.Sox30不仅可以转录调控波形蛋白的表达,还可以通过ERK1/2信号通路影响波形蛋白的磷酸化,在小鼠睾丸支持细胞波形蛋白骨架解聚及生精细胞脱落中具有重要作用。