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蛋白酶K是一类对蛋白质类物质进行专一水解的酶,生产生活用途广泛,用量大。蛋白酶K最早于1974年从林伯氏白色念球菌中纯化得到。但一直以来天然菌株培养困难、产量过低的问题严重阻碍了蛋白酶K的实际应用。1985年测定其天然氨基酸序列后,多个国家的研究者及相关公司投入了很大力量尝试该蛋白的大规模重组表达,并于2000年前后在大肠杆菌系统中获得成功。但此方法只能得到包涵体蛋白,变复性过程导致酶活力损失严重;2008年后该蛋白的毕赤酵母系统分泌表达获得突破。至此,蛋白酶K的生产和应用进入了一个快速发展的时期。本实验室构建了一株能高效表达蛋白酶K的毕赤酵母工程菌,本文对此菌株的生长产酶特性及发酵工艺进行了研究。1.研究了该菌株的生长特性,表明:此株菌株的生长对数期在10～30h之间;2.研究获得摇瓶发酵的最佳条件:诱导期温度25℃,甲醇浓度1%,诱导期山梨醇添加量6g/L,诱导96h,发酵液的酶活力可达到7235.68U/ml;3.对罐上发酵进行了优化,罐上发酵的最佳条件为:诱导前菌体湿重积累至330g/L,甲醇采用指数-恒定速率方式流加,其中前12h采用指数流加,后改为恒定速率流加,速率基本维持在0.2ml/min/L,诱导期pH=4,诱导期温度为25℃,开始诱导时,一次性加入发酵液体积10%(w/v)的山梨醇固体。最终所获得发酵液中蛋白酶K酶活提高至15.0×10~4U/ml左右,为优化前的3倍;4.采用聚醚砜卷式膜过滤对发酵液进行纯化处理,得到纯度为98.69%蛋白酶K酶液;5.通过正交试验得到喷雾干燥制备酶粉的最佳参数为:进口温度160℃、保护剂PEG2万添加量为2%、雾化速度300L/h,得到的蛋白酶K酶粉能保留93.96%的酶活力;6.菌体回收后重复发酵的结果表明:首次发酵结束后所回收的菌体,经上罐重新诱导60h时,发酵液中蛋白酶K的酶活力可达到5.0×10~4U/ml以上,有一定回收利用价值,但进行第二轮重复发酵时,酶活下降至2.0×10~4U/ml,下降明显。综上所述,通过本课题的研究,将毕赤酵母工程菌表达蛋白酶K的表达量提高至国内外报道的最高水平,为工业化生产奠定了基础。