前言:肺癌是当今全世界范围内对人类健康威胁最大的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌（NSCLC）占据80%。尽管非小细胞肺癌中存在EGFR及ALK等基因突变,可选用靶向药物治疗,然而仅仅适用于部分存在基因突变的病例,而且早期出现较高耐药率使目前的基因靶向治疗效果受到了巨大限制。因此,揭示与非小细胞肺癌细胞增殖与转移相关的蛋白,对于非小细胞肺癌的早期诊断及开发新的靶向药物均具有重要意义。复制因子C（replication factor C,RFC）是由5个独特亚基构成的蛋白复合物,这5个亚基分别为RFC1,RFC2,RFC3,RFC4,RFC5,分子量分别为140,40,38,37和36 kDa。DNA聚合酶δ和DNA聚合酶ε对引物DNA模板的延伸需要辅助蛋白增殖细胞核抗原（PCNA）和复制因子C,复制因子C又称活化因子1（acvitor1）,是真核细胞DNA聚合酶全酶的一部分,其在DNA复制,DNA损坏修复及合成调控中起重要作用。DNA复制是癌症进展和肿瘤细胞周期中的重要环节。由此推测RFC基因的异常扩增与癌细胞的增殖和侵袭可能有关。相关研究表明RFC1可以与脱乙酰化酶1作用来调节转录,是调节NF-kappaB途径活性的重要因素;RFC2在鼻咽癌中高表达,与原癌基因C-MYC关系密切;RFC4不仅在肝癌中呈现高表达,沉默后癌细胞的增殖受到抑制,坏死细胞增多,并且对化疗的敏感度增加了,除此之外,RFC4还在肺,前列腺,结肠,胃和皮肤恶性肿瘤中呈现出相对于癌旁组织高表达的趋势,RFC4还在肺纤维化的猴空泡病毒40（SV40）永生化细胞中高表达,提示RFC可能是最早参与肿瘤恶变的蛋白;RFC5则在人类乳头病毒阳性的鳞状细胞癌中被发现高表达。RFC3为5个亚基中分子量为38KDa的蛋白,为其他三个小亚基与大亚基RFC1相互作用的必须蛋白。RFC3已前后被报道与三阴乳腺癌,肝癌,卵巢癌,急性髓性细胞白血病,食管腺癌细胞的增殖,或侵袭,迁移相关。然而,RFC3在非小细胞肺癌中的作用仍然未做深入研究。目的:在本次研究中,我们探索了RFC3在非小细胞肺癌组织中及癌旁组织中的表达情况,及其与各临床特征的关联以及与预后的关系。另外,我们采用MTT法,流式细胞术分析,侵袭,迁移,划痕试验来评估当RFC3改变时,A549及H1299两个细胞系增殖,凋亡以及侵袭迁移能力的变化。最后根据查阅文献,生物信息学分析并利用Western blot来评估下游蛋白的变化来寻找RFC3在两个细胞系的作用通路。研究方法:1、收集2010年3月至2013年6月165例在中国医科大学附属第一医院胸外科接受手术治疗的有完整随访资料的非小细胞肺癌患者的临床病理信息,其中经病理科医师诊断为肺腺癌123例,肺鳞癌42例。通过免疫组化评估RFC3基因在非小细胞肺癌患者癌组织及癌旁组织中的表达情况,通过卡方检验、单因素分析及多因素分析探讨RFC3与非小细胞肺癌患者各临床指标及预后的相关性。利用Kaplan-Meier法比较RFC3的表达水平对患者整体生存期的影响。2、通过Western blot检测各个非小细胞肺癌细胞系RFC3的表达情况并与人类支气管上皮细胞RFC3的表达情况做对比。在肺腺癌细胞系A549及H1299中,分别通过过表达质粒及RNA沉默片段siRNA上调及下调RFC3表达。通过MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡变化情况,Transwell侵袭及迁移试验和划痕实验检测细胞侵袭及迁移的能力来验证RFC3对肺腺癌细胞生物学行为的影响。3、在肺腺癌细胞系A549及H1299中,分别通过过表达质粒及RNA沉默片段siRNA上调及下调RFC3表达。使用Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白wnt1,β-Catenin,C-MYC,P-GSK3-β（Ser9）与GSK3-β的比值,及上皮间质化相关蛋白E-Cadherin,N-Cadherin和Vimentin表达水平的变化。结果:1、在免疫组化研究中,123例腺癌及对应癌旁组织RFC3高表达的比例分别为46.34%和20.33%,差异具有统计学意义。但42例鳞癌及对应癌旁组织RFC3高表达比例分别为16.67%和11.90%,差异无统计学意义。RFC3的表达与TNM分期,分化程度,淋巴结转移的情况相关。多因素分析提示RFC3的表达是影响肺腺癌患者生存期的独立因素。单因素分析提示RFC3的表达对肺鳞癌患者的生存期没有明显影响。Kaplan-Meier生存分析提示RFC3低表达的患者较高表达患者生存期明显延长,无复发生存期也明显延长。2、在非小细胞肺癌细胞系中除A549和LK2细胞系与正常人类支气管上皮细胞系RFC3表达无明显差异外,其余非小细胞肺癌细胞系RFC3的表达水平均明显高于正常人类支气管上皮细胞系。MTT法增殖曲线提示上调或下调RFC3没有对A549及H1299细胞的增殖造成影响,流式细胞仪分析结果提示上调RFC3后可促进A549细胞由G0/G1期进入S期,而下调RFC3后H1299细胞会停滞于G0/G1期。上调RFC3凋亡细胞数量减少但与对照组无明显差异,下调RFC3凋亡细胞明显增多。分别给A549,H1299细胞系中加入紫杉醇和厄洛替尼诱导凋亡后上调RFC3凋亡细胞数量明显减少,下调RFC3凋亡细胞明显增多。Transwell侵袭和迁移试验及划痕实验提示RFC3上调后A549细胞侵袭和迁移能力增强,RFC3下调后H1299细胞侵袭和迁移能力减弱,说明RFC3对肺腺癌的侵袭和迁移能力有影响作用。3、在A549中RFC3过表达后,wnt1、β-Catenin、C-MYC、N-Cadherin和Vimentin的表达增加,P-GSK3-β（Ser）/GSK3-β增高,而E-Cadherin的表达降低。在H1299中RFC3被敲除后,wnt1、β-Catenin、C-MYC、N-Cadherin和Vimentin的表达降低,P-GSK3-β（Ser）/GSK3-β降低,而E-Cadherin的表达增加。提示RFC3可能通过激活A549和H1299细胞wnt/β-catenin信号通路,促进肺腺癌的上皮细胞间质化来造成癌细胞的侵袭和转移。结论:1、RFC3在肺腺癌组织中表达较癌旁组织中高,其表达情况与肺腺癌患者的TNM分期,肿瘤细胞分化程度,淋巴结转移情况相关。2、RFC3的表达是影响肺腺癌生存期的独立危险因素,RFC3高表达的患者具有较短的整体生存期和无复发生存期。3、RFC3与肺腺癌细胞的侵袭和迁移能力呈正相关,RFC3表达可加速细胞周期进程并且减少细胞凋亡。4、RFC3可能通过激活A549和H1299细胞wnt/β-catenin信号通路,促进肺腺癌的上皮细胞间质化来造成癌细胞的侵袭和转移。