目的明确硒和硒蛋白在防治高血糖加重脑缺血损伤中的作用,及其缓解脑缺血损伤是否与稳定线粒体通路,尤其是稳定线粒体分裂/融合平衡有关。方法第一部分硒(亚硒酸钠)减缓高乳酸和高糖+缺氧培养对神经细胞损伤的作用研究HT22细胞(海马椎体神经细胞)分为对照组(control)、高乳酸损伤组(LA)、高糖+缺氧损伤组(HG+H)、高乳酸+亚硒酸钠组(LA+Se)及高糖+缺氧+亚硒酸钠组(HG+H+Se);Sel H-HT22细胞(高表达Sel H的HT22细胞)及V-HT22细胞(空载体的HT22细胞)对照组(control)、高乳酸损伤组(LA)、高糖+缺氧损伤组(HG+H)。给予相应处理后,检测细胞活性、光镜变化及细胞凋亡情况。第二部分动物实验研究硒在减轻高血糖加重脑缺血再灌注损伤中的作用及与线粒体通路的关系实验动物随机分为正常血糖组(NH)、糖尿病组(GH)、糖尿病硒治疗组(GH+Se)、糖尿病胰岛素治疗组(GH+insulin)、糖尿病硒+胰岛素共治疗组(GH+Se+insulin),每组分别设有对照组(control)、假手术组(sham)、缺血再灌注24小时组(I/R24h)及缺血再灌注72小时组(I/R72h),每组10只SD大鼠。采用链脲佐菌(Streptozotocin,STZ,60mg/kg)制备Ⅰ型糖尿病模型,模型成功4周后按照分组给予亚硒酸钠0.4mg/kg及精蛋白锌胰岛素2U/d腹腔注射,持续4周后,通过大脑中动脉缺血(MCAO)建立局灶脑缺血再灌注模型。通过免疫组织化学染色、尼氏染色、电镜及western blotting等方法,检测半暗带区Iba1、GFAP的变化、线粒体分裂/融合相关因子Drp1,Fis1,Opa1,Mfn2线粒体自噬相关因子LC3 I/II的表达。第三部分细胞实验研究硒通过保护线粒体功能,稳定线粒体通路,减轻高血糖脑缺血状态对神经细胞的损伤HT22细胞分为对照组(control)、高乳酸损伤组(LA)、高糖+缺氧损伤组(HG+H)、高乳酸+亚硒酸钠组(LA+Se)及高糖+缺氧+亚硒酸钠组(HG+H+Se);Sel H-HT22及V-HT22细胞分为对照组(control)、高乳酸损伤组(LA)、高糖+缺氧损伤组(HG+H)。给予相应处理后,检测线粒体形态变化、线粒体膜电位的变化、线粒体分裂/融合相关因子Drp1,Fis1,Opa1,Mfn2及线粒体自噬相关因子LC3 I/II的表达。结果第一部分硒(亚硒酸钠)减缓高乳酸和高糖+缺氧培养对神经细胞损伤的作用研究(1)细胞活性检测结果:5m M乳酸及50m M葡萄糖+缺氧使HT22细胞活性随着时间延长逐渐下降、而使用100n M亚硒酸钠共同孵育后各组细胞活性不同程度上升。5m M乳酸及50m M葡萄糖+缺氧使Sel H-HT22及V-HT22细胞活性随着时间延长逐渐下降,但是Sel H-HT22组细胞活性较V-HT22细胞下降的明显少。(2)光镜结果:对照组HT22细胞生长良好;高乳酸及高糖+缺氧损伤后HT22细胞大小不一,部分细胞皱缩,细胞间隙增大,胞浆减少,其中可见凋亡细胞;亚硒酸钠共同孵育组损伤减轻。对照组V-HT22细胞和Sel H-HT22细胞生长良好,高乳酸及高糖+缺氧损伤后部分V-HT22细胞大小不一,细胞皱缩呈类圆形,细胞间隙增大,胞浆减少,甚至凋亡、脱离瓶壁;而Sel H-HT22组的损伤细胞相较V-HT22组少。(3)流式细胞仪Annexin-V/PI双染法检测结果:高乳酸及高糖+缺氧损伤使HT22细胞晚期凋亡、继发性坏死细胞数显著增多,而亚硒酸钠共孵育组晚期凋亡、继发性坏死细胞数明显减少(P<0.05)。高乳酸及高糖+缺氧损伤使V-HT22细胞和Sel H-HT22细胞晚期凋亡、继发性坏死细胞数明显增加,但是Sel H-HT22细胞较V-HT22细胞的晚期凋亡、继发性坏死细胞数明显少(P<0.05)。(4)Endo G检测结果:高乳酸及高糖+缺氧损伤使HT22细胞入核Endo G数量增加,亚硒酸钠使之减少。高乳酸及高糖+缺氧损伤使V-HT22细胞和Sel H-HT22细胞入核Endo G数量增加(P<0.05),但是Sel H-HT22细胞较V-HT22细胞的入核Endo G数量明显少(P<0.01)。第二部分动物实验研究硒在减轻高血糖加重脑缺血再灌注损伤中的作用及与线粒体通路的关系的研究结果(1)大鼠血糖测定:GH各组大鼠血糖均高于正常对照组(P<0.01);各组术后血糖明显高于其他时间点(P<0.01),GH+insulin组与GH+Se组比较具有统计学意义(P<0.01),GH+Se+insulin组与GH+Se组比较具有统计学意义(P<0.01),但是GH+insulin组与GH+Se+insulin组比较没有明显差异(P>0.05)。(2)大鼠体重变化率:除NH组大鼠体重变化率呈增长趋势外,其他各组糖尿病大鼠体重变化率均呈下降趋势,且与NH组比较具有显著差异(P<0.01)。给予亚硒酸钠和胰岛素干预后,与GH组相比较,GH+insulin、GH+Se及GH+Se+insulin三组体重变化率均升高(P<0.01)。GH组与GH+insulin组比较具有统计学差异(P<0.01),GH组与GH+Se+insulin组比较具有统计学差异(P<0.01),然而,GH组与GH+Se组比较没有明显差异(P>0.05),GH+insulin组与GH+Se+insulin组也没有明显差异(P>0.05)。(3)外周血血清硒蛋白测定:与NH组大鼠血清硒蛋白含量相比,只有GH+Se+insulin组大鼠血清硒蛋白明显增高(P<0.05),GH+Se+insulin组显著高于GH+insulin组和GH+Se组(P<0.05),单独给予亚硒酸钠或者胰岛素并不能使得血清硒蛋白升高,析因分析结果显示亚硒酸钠与胰岛素之间不存在协同作用。(4)神经功能评分:假手术组大鼠无神经损伤症状,置于平衡木上可顺利通过,很少跌倒,行走T型迷宫时几乎不会重复进入相同的臂;NH组大鼠MCAO后出现不能完全伸展手术对侧前爪或后爪、行走时向手术对侧转圈的症状,置于平衡木上能穿过、跌倒机会增加,行走T型迷宫时错误率为47.33±1.45%;GH组大鼠MCAO后出现不能完全伸展手术对侧前爪或后爪、行走时向手术对侧转圈、向手术对侧倾倒甚至不能自发行走、意识丧失,置于平衡木上能穿过、跌倒机会增加甚至不能坐在平衡木上,行走T型迷宫时错误率为79±2.08%;GH+Se组大鼠MCAO后也出现不能完全伸展手术对侧前爪或后爪、行走时向手术对侧转圈、向手术对侧倾倒甚至不能自发行走、意识丧失,行走T型迷宫时错误率为74.33±2.03%;而GH+insulin组和GH+Se+insulin组MCAO后神经功能损伤较GH组和GH+Se组减轻,极少出现不能自发行走、意识丧失,大部分均能穿过平衡木,行走T型迷宫时错误率分别为67.33±1.76%、68.33±1.45%。(5)TTC染色检测梗死体积和梗死面积:缺血30min,再灌注24h、72h后取脑组织进行TTC染色,再灌注24h,与NH组相比较,糖尿病各组脑梗死面积增大;再灌注72h可见除GH组外,其余各组TTC染色均呈红色。缺血20min,再灌注24h后取脑组织进行TTC染色,sham组脑组织TTC染色呈红色,而MCAO脑组织呈苍白色,与NH组相比较,MCAO脑梗死体积明显增加(P<0.01);与GH组比较,GH+insulin组、GH+Se组及GH+Se+insulin组的梗死体积明显减少(P<0.01);GH+Se+insulin组梗死体积小于GH+Se组,二者比较具有显著差异(P<0.05),GH+Se组与GH+insulin组梗死体积比较无统计学意义。(6)形态学观察:(1)HE染色:光镜下HE染色可以观察到缺血中心区主要为纹状体区、顶叶皮质及颞叶皮质区。NH control组细胞结构排列层次分明,间质无水肿。细胞质着色均匀,细胞核居中,染色质分布均匀。GH、GH+Se、GH+insulin、GH+Se+insulin control组细胞间质轻度水肿,毛细血管增生,少量细胞出现变性、核固缩。NH I/R24h组染色变淡,神经元和胶质细胞较少,部分细胞收缩呈多边形,胞质呈空泡样,细胞核固缩。GH I/R 24h组染色明显变淡,间质高度水肿,散在炎细胞,神经元和胶质细胞明显减少,有少量残存神经细胞,残存细胞体积变小,收缩呈多角形,部分胞质溶解呈空泡样,核固缩。GH+Se I/R24h组残存神经元和胶质细胞的量较GH I/R 24h组稍多,间质水肿程度减弱。GH+insulin I/R24h组的缺血性改变较GH+Se I/R 24h组减轻;GH+Se+insulin I/R 24h组的这种改变进一步减轻。NH I/R 72h组可见细胞间质水肿减轻而变得致密,毛细血管增生,胶质细胞增生,炎细胞浸润;GH I/R 72h组仍然可见间质明显水肿,毛细血管大量增生,凋亡坏死的细胞逐渐消失,炎细胞、胶质细胞增生浸润;GH+Se I/R 72h组间质水肿较GH I/R 72h组轻,见增生的毛细血管及炎细胞和胶质细胞浸润;GH+insulin和GH+Se+insulin I/R72h组水肿明显减轻,毛细血管及炎细胞和胶质细胞浸润,见散在残存神经元。(2)尼氏染色:可以观察到NH control组细胞胞体和突起轮廓清晰、尼氏体丰富、深染,细胞核淡染,背景略呈浅蓝色;GH、GH+Se、GH+insulin及GH+Se+insulin control组细胞质染色变淡;NH I/R 24h组残存水肿的神经细胞胞质淡染、皱缩的神经细胞胞质浓缩深染;GH I/R 24h组见少量残存淡染的神经细胞;GH+Se I/R 24h组见少量残存皱缩的神经细胞,胞质浓缩深染;GH+insulin I/R 24h组残存神经细胞较GH+Se I/R 24h组增多,这些神经细胞大部分皱缩深染;GH+Se+insulin I/R24h组残存的神经细胞进一步增多,细胞质或深染或淡染;NH I/R72h组见少量神经细胞轮廓尚清晰,胞质染色均一;GH I/R 72h组见很少量的胞质淡染神经细胞,细胞轮廓不清;GH+Se、GH+insulin及GH+Se+insulin I/R 72h组残存胞质淡染神经细胞逐渐增多,且细胞轮廓不甚清楚。(3)电镜结果:电镜下观察到I/R24h神经元及胶质细胞缺血侧及未损伤侧超微结构变化,神经元损伤较胶质细胞稍轻,而未损伤侧的超微结构也有变化。缺血侧神经元细胞的线粒体轻度肿胀,嵴排列紊乱、变短、消失,溶酶体及脂质体数量增加;缺血侧胶质细胞线粒体肿胀呈椭圆形、球形,溶酶体及脂质体数量较神经元少。未损伤侧神经元细胞可见线粒体嵴排列稍紊乱,少量溶酶体及脂质体;而未损伤侧的胶质细胞部分线粒体肿胀,嵴排列紊乱、变短、消失,见少量溶酶体及脂质体。(7)大鼠缺血半暗带小胶质的变化:对照组可见脑实质内有少量静止期分枝型小胶质细胞,其形态为胞体小、分枝细,各组间并无差异;缺血再灌注后,Iba1阳性小胶质细胞迅速被激活,并向损伤区迁移,I/R24h半暗带Iba1阳性细胞数目无明显变化,但是细胞形状变得不规则,胞体变大,突起粗大,其中GH+Se组及GH+Se+insulin组与NH control组及GH control组、GH+insulin组比较具有统计学意义(P<0.01,P<0.05,P<0.05);I/R 72h半暗带Iba1阳性细胞数目明显增多,形态呈阿米巴样,各组与其相应的control及I/R24h组比较均具有统计学意义(P<0.01),GH+Se+insulin组除外;糖尿病各组小胶质细胞数目的增多与NH组具有统计学意义,与GH组比较GH+insulin组和GH+Se+insulin组的小胶质细胞数明显少;GH+Se+insulin组与GH+insulin组及GH+Se组明显少。(8)大鼠缺血半暗带星形胶质细胞变化:对照组脑实质内见少量散在星形胶质细胞,NH control组星形胶质细胞胞体小、分枝纤细,GH各组星形胶质细胞胞体略增大,分枝增粗,其中GH组与NH组比较具有统计学意义(P<0.05);缺血再灌注后,GFAP阳性的星形胶质细胞数目增多,胞体变大,分枝增多、变粗;I/R24h半暗带GFAP阳性细胞数目增多,与同组control比较具有统计学意义,但是同一时间点各组间比较无明显差异;I/R 72h半暗带GFAP阳性细胞数目明显增多,其中GH组与NH组比较具有统计学意义(P<0.05),各组中I/R72h与control比较阳性细胞数显著增多(P<0.01)、I/R72h与I/R24h比较阳性细胞数也明显增多。GH+insulin组、GH+Se+insulin组及GH+Se组I/R后在星形胶质细胞数量上与GH组无明显差异,但是星形胶质细胞形态有改变,细胞分枝少而细,胞体略小。(9)缺血半暗带线粒体分裂/融合相关因子表达结果:(1)线粒体分裂相关因子Fis1的检测结果:GH组和GH+Se组的对照组Fis1的表达量明显高于NH组。I/R 24h半暗带区Fis1的表达量明显增加,NH组、GH+insulin组及GH+Se+insulin组Fis1的表达量与同处理组的control比较均显著增加(P<0.01,P<0.05,P<0.01),而且GH及GH+Se+insulin组明显高于NH组,GH+Se、GH+insulin及GH+Se+insulin组比GH组Fis1的表达量少(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。I/R 72h半暗带区Fis1的表达量进一步增加,其中GH组、GH+Se组及GH+insulin组I/R 72h比I/R 24h的Fis1表达量增加(P<0.01,P<0.05,P<0.05);糖尿病各组大鼠均比NH组的Fis1表达量明显增加,给予Se及insulin组比GH组的Fis1表达量明显减少(均P<0.01)。(2)线粒体分裂相关因子Drp1的检测结果:GH control组Drp1的表达量明显高于NH组。I/R 24h半暗带区Drp1的表达量较control明显增加,GH+Se、GH+insulin及GH+Se+insulin组Drp1的表达量比NH、GH组均增加,而GH+insulin组比GH+Se、GH+Se+insulin组表达量少。I/R 72h半暗带区Drp1的表达量只有GH组增加,除GH+insulin组外其余4组Drp1的表达量较NH组明显增加(均P<0.01)。(3)线粒体融合相关因子Mfn-2的检测结果:各对照组Mfn-2的表达无明显差异。I/R24h半暗带区Mfn-2的表达量均不同程度地增加了,其中GH组及GH+insulin组Mfn-2的表达量较NH组比较明显少(P<0.01),而GH+Se+insulin组比NH组明显增加(P<0.01),GH+insulin组比GH+Se组及GH+Se+insulin组Mfn-2的表达量少(P<0.01,P<0.01),GH组比GH+Se+insulin组明显少(P<0.01)。I/R 72h半暗带区Mfn-2的表达量除外GH组,其余4组均不同程度降低,GH组及GH+Se+insulin组Mfn-2的表达量较NH组明显高(P<0.01,P<0.01),GH+Se组、GH+insulin组及GH+Se+insulin组比GH组的Mfn-2表达量明显少(均P<0.01),GH+Se+insulin组比GH+Se组及GH+insulin组明显多。(4)线粒体融合相关因子Opa1的检测结果:各对照组Opa1的表达无明显差异。I/R 24h半暗带区Opa1的表达量均不同程度地增加了,GH组组、GH+Se组及GH+insulin组Opa1的表达量比NH组明显减少,GH+Se+insulin组则比NH组、GH组、GH+Se组及GH+insulin组明显增加,GH+Se也比GH组Opa1的表达量增加,同一处理组内除外GH+insulin组,其他4组I/R 24h明显比control的Opa1的表达量高。I/R 72h半暗带区Opa1表达量减少,其中除GH组进一步增加外,但是同一时间点内GH及GH+Se+insulin组Opa1的表达量较NH组、GH+Se组及GH+insulin组明显高(均P<0.01)。(10)线粒体自噬相关因子LC3 I/II的表达:GH组、GH+Se组、GH+insulin组及GH+Se+insulin组的control比NH组LC3 II/LC3 I比值明显升高。I/R 24h半暗带区LC3 II/LC3 I比值均不同程度升高,GH组、GH+insulin组比NH组明显高(均P<0.01),而GH+Se+insulin组则降低(P<0.05),GH+Se组、GH+insulin组及GH+Se+insulin组比GH组的LC3 II/LC3 I比值明显降低(均P<0.01,)各处理组内I/R 24h与control比较LC3 II/LC3 I比值明显高。I/R 72h半暗带区LC3 II/LC3 I比值均不同程度降低,GH组、GH+insulin组比NH组明显高(均P<0.01),而GH+Se+insulin组则降低(P<0.05);GH+Se+insulin组除外,同一处理组内I/R 72h比control的LC3 II/LC3 I比值高。第三部分细胞实验研究硒对减轻高血糖脑缺血状态(高乳酸和高糖氧剥夺)神经细胞损伤的作用及与线粒体关系的研究结果(1)线粒体形态观察:(1)通过15000倍透射电镜观察到,对照组HT22细胞膜、胞核完整,细胞器丰富;细胞内可见双层胞核完整,线粒体嵴整齐、清晰,胞质内有发达的粗面内质网,内质网形态正常、颗粒分布均匀完整。LA组细胞器明显减少,线粒体肿胀呈圆形,嵴变短、消失;胞浆内溶酶体数量增多,可见自噬体;大量粗面内质网高度扩张、脱颗粒,形成空泡样结构。而LA+Se组的细胞相较损伤组损伤明显减少,残存线粒体多。HG+H组细胞器明显减少,线粒体数目也明显减少,并且肿胀呈圆形,嵴变短、消失;胞浆内溶酶体数量增多,可见自噬体;大量粗面内质网高度扩张、脱颗粒,形成空泡样结构。而HG+H+Se组的细胞相较损伤组损伤明显减少。(2)15000倍透射电镜观察到,对照组V-HT22细胞和Sel H-HT22细胞的细胞膜、胞核完整,细胞器丰富;细胞内可见双层胞核完整,线粒体嵴整齐、清晰,粗面内质网发达且形态正常、颗粒分布均匀完整。LA干预后V-HT22细胞器明显减少,几乎所有线粒体肿胀呈圆形,嵴变短、消失,呈空泡样,胞浆内溶酶体数量增多,可见自噬体;大量粗面内质网高度扩张、脱颗粒,呈囊状扩张。而Sel H-HT22细胞相较损伤组损伤明显减少,可见线粒体肿胀、嵴变短,胞浆内溶酶体数量增多,可见自噬体,粗面内质网扩张,部分脱颗粒。HG+H干预后V-HT22细胞器明显减少,大部分线粒体肿胀呈圆形,嵴变短、消失,呈空泡样,胞浆内溶酶体数量增多,可见自噬体;大部分粗面内质网高度扩张、脱颗粒,呈囊状扩张。而Sel H-HT22细胞相较损伤组损伤明显减少,可见部分线粒体肿胀、嵴变短,胞浆内溶酶体数量增多,可见自噬体,部分粗面内质网扩张、脱颗粒。(2)流式细胞仪JC-1染色检测结果:LA及HG+H损伤使HT22细胞橙红色/绿色荧光比值显著下降(P<0.01),亚硒酸钠共孵育组橙红色/绿色荧光比值较前者下降明显减少(P<0.05)。LA及HG+H损伤使V-HT22细胞和Sel H-HT22细胞橙红色/绿色荧光比值显著下降,但是Sel H-HT22细胞橙红色/绿色荧光比值较V-HT22细胞下降明显少(P<0.05)。(3)线粒体分裂相关因子Fis1检测结果:LA和HG+H处理后Fis1表达较control组显著上调(均P<0.01),而亚硒酸钠保护细胞减少Fis1的上调,且LA组与LA+Se组比较具有统计学差异(P<0.05),HG+H组与HG+H+Se组比较具有统计学意义(P<0.01)。V-HT22对照组和Sel H-HT22对照组蛋白表达量没有明显差异,然而LA和HG+H损伤细胞后,Sel H-HT22组和V-HT22组Fis1的蛋白表达量明显上调,与control比较具有统计学意义(均P<0.01),但是Sel H-HT22组Fis1蛋白表达上调明显较V-HT22组少(P<0.05,P<0.01)。(4)线粒体分裂相关因子Drp1检测结果:LA处理后Drp1(0.581±0.010)表达较control显著上调(P<0.01),而亚硒酸钠保护细胞减少Drp1表达上调。HG+H培养HT22细胞后,线粒体分裂相关因子Drp1(P<0.01)表达显著上调,而亚硒酸钠共培养后减少了Drp1表达的上调,与HG+H组比较具有统计学意义(P<0.01)。(5)线粒体分裂相关因子p-Drp1检测结果:LA和HG+H处理后p-Drp1表达较control显著上调(均P<0.01),而亚硒酸钠保护细胞减少p-Drp1的上调,LA组与LA+Se组比较具有统计学差异(P<0.01),与HG+H组比较具有统计学意义(P<0.05)。V-HT22对照组和Sel H-HT22对照组蛋白表达量没有明显差异,然而LA和HG+H损伤细胞后,Sel H-HT22组和V-HT22组p-Drp1的蛋白表达量明显上调,与control比较具有统计学意义(均P<0.01),但是Sel H-HT22组Drp1蛋白表达上调与V-HT22组并无显著差异(P>0.05)。(6)线粒体融合相关因子Mfn-2检测结果:HT22细胞LA及HG+H组Mfn-2的表达量较control明显上调(均P<0.01),亚硒酸钠共培养后Mfn-2的表达量较LA组和HG+H组进一步上调(均P<0.05)。V-HT22对照组和Sel H-HT22对照组蛋白表达量没有明显差异,然而LA和HG+H损伤细胞后,Sel H-HT22组和V-HT22组Mfn-2的蛋白表达量明显上调,与control比较具有统计学意义(均P<0.01),但是Sel H-HT22组Mfn-2蛋白表达上调明显较V-HT22组少(P<0.05,P<0.01)。(7)线粒体融合相关因子Opa1检测结果:HT22细胞给予LA和HG+H干预后Opa1的表达明显上调,与control比较具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);亚硒酸钠共培养后Opa1表达进一步上调,且与LA组、HG+H+Se组比较具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。V-HT22对照组和Sel H-HT22对照组蛋白表达量没有明显差异,然而LA和HG+H损伤细胞后,Sel H-HT22组和V-HT22组Opa1的蛋白表达量上调,与control比较具有统计学意义(均P<0.01),且与V-HT22组相比较,Sel H-HT22组蛋白表达上调更明显(P<0.05)。(8)线粒体自噬相关因子LC3 I/II检测结果:LA和HG+H处理HT22细胞后LC3 II/LC3 I的比值明显增加(均P<0.01),而亚硒酸钠降低了比值的增加(P<0.01),且与LA组比较具有统计学意义(P<0.05),与HG+H组比较具有统计学意义(P<0.05)。V-HT22对照组和Sel H-HT22对照组LC3 II/LC3 I没有明显差异,然而LA和HG+H损伤后V-HT22组和Sel H-HT22组LC3 II/LC3I比值均增加,但是与V-HT22组比较,Sel H-HT22组LC3 II/LC3 I比值增加量减少了(P<0.01,P<0.01)。结论1.亚硒酸钠和Sel H能减缓高血糖脑缺血状态(高乳酸和高糖氧剥夺)对神经细胞的损伤。2.亚硒酸钠和Sel H可能通过稳定线粒体分裂/融合失衡和自噬减轻高血糖加重脑缺血再灌注损伤。