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真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factors, eIFs)是一类重要的细胞内功能蛋白,形成蛋白质翻译起始复合物,引导蛋白质合成的起始。已明确的eIFs有六种(eIF1～eIF6),每种eIF由多个亚基组成。近年来不断有研究发现一此eIFs的亚基在肿瘤细胞中存在异常表达的现象,并且这些亚基表达的异常与肿瘤的恶性行为相关,如eIF4E在肿瘤细胞中表达异常升高,可以作为一个有效的治疗靶点,因此eIFs在肿瘤的发生发展中的作用越来越受到人们的关注。eIF3是最大最复杂的一个真核翻译起始因子,是蛋白质翻译起始复合物中与其他翻译起始因子相互联系的中心蛋白因子之一。目前已知eIF3由13个亚基组成,分子量约为700～800kD,其各亚基按分子量递减分别命名为eIF3a至eIF3m。eIF3g是eIF3的一个核心亚基,在翻译终止后的再起始过程中起着重要作用,并且该亚基还具有与细胞骨架蛋白4.1R和凋亡诱导因子AIF相结合的位点。本课题组在前期实验中发现eIF3g在耐药的白血病细胞中高表达,下调白血病细胞中eIF3g的表达可以抑制白血病细胞的耐药性及生长；在乳腺癌临床标本中,eIF3g的过表达与淋巴转移正相关。这些发现给我们进一步研究eIF3g在肿瘤中的机制提供了依据,我们设想在肿瘤中异常表达的eIF3g蛋白有可能通过非翻译起始相关的机制在肿瘤的发生发展中发挥了一定的作用。在本课题中,我们首先通过生物信息学手段预测了eIF3g可能具有细胞核定位,进一步用实验验证了eIF3g的核定位,并寻找、鉴定与之相互作用的核蛋白,为今后的研究提供线索。我们通过核质分离技术结合Western blot、细胞免疫荧光染色验证了eIF3g在细胞核中的存在,通过核蛋白免疫共沉淀结合质谱分析鉴定了与eIF3g在细胞核中相互作用的蛋白质,包括不均一核糖核蛋白(hnRNP U),锌指蛋白(HSZFP36),和肌动蛋白(β-actin),并采用了正反向的免疫共沉淀、化学交联、GST-pulldown以及激光共聚焦共定位观察等多种技术进行了多方面验证。具体内容如下：1.预测并验证eIF3g的细胞核定位通过在线生物信息学工具WoLF PSORT (http://wolfpsort.org), PROST II Prediction (http://psort.hgc.jp/form2.html), Subnuclear Compartments Prediction System (http://array.bioengr.uic.edu/subnuclear.htm)和PredictProtein (https://www.predictprotein.org)预测eIF3g的亚细胞定位及功能,通过核质分离后Western blot检测和激光共聚焦观察验证eIF3g的亚细胞定位。四个生物信息学工具都预测了eIF3g具有细胞核定位,PredictProtein预测了eIF3g在细胞核中具有结合DNA和RNA等功能。细胞核蛋白的Western blot检测和细胞免疫荧光染色结合激光共聚焦观察都验证了eIF3g具有细胞核定位。2.鉴定与eIF3g相互作用的核蛋白为了进一步研究eIF3g在细胞核中相互作用的蛋白质,我们构建了稳定过表达eIF3g的Bcap37/Tet-On-eIF3g细胞株,分离细胞核并裂解获得核蛋白,以eIF3g抗体进行免疫共沉淀,SDS-PAGE电泳分离后考马斯亮蓝染色,选取共沉淀的蛋白条带进行质谱分析鉴定。与对照相比,免疫共沉淀得到4条较明显的蛋白条带,质谱分析鉴定分别为真核细胞翻译起始因子3A (eIF3A)、不均一核糖核蛋白(hnRNP U)、锌指蛋白(HSZFP36)和肌动蛋白(β-actin),这些蛋白均通过Western blot和激光共聚焦观察证实存在于核蛋白组分中。3.验证与eIF3g相互作用的核蛋白分离Bcap37/Tet-On-eIF3g细胞核,将细胞核蛋白进行正反向免疫共沉淀,正向免疫共沉淀结果表明eIF3g抗体可沉淀出hnRNP U、HSZFP36、β-actin,反向共沉淀结果表明hnRNP U、HSZFP36、β-actin抗体可沉淀出eIF3go对核蛋白进行化学交联后利用Western blot检测,结果表明eIF3g可与hnRNP U、HSZFP36和β-actin结合成复合体。我们还构建了质核表达GST-eIF3g融合蛋白的载体,转化细菌后诱导表达,与Bcap37细胞核蛋白及连接磁珠的GSH相互作用后进行Western blot检测,结果表明GST-eIF3g可以下拉hnRNP U、HSZFP36和β-actin。此外,对Bcap37/Tet-On-eIF3g细胞进行eIF3g的免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜也观察到eIF3g与HSZFP36和β-actin的共定位。因此,免疫共沉淀、化学交联、GST-pulldown和激光共聚焦观察共定位都证实了eIF3g与HSZFP36和β-actin相互作用。创新性结论：本研究首次发现并证明eIF3g可以进入细胞核,并能与hnRNP U、 HSZFP36、β-actin等核蛋白相互作用。