论文部分内容阅读
[目的和背景]目前肺癌仍是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,其5年总生存率也仅仅在10%~20%,治疗后容易出现复发、耐药及转移,是导致肺癌患者死亡的最主要原因。肺癌的发生发展是多因素、多基因共同作用及多阶段最终形成的过程。microRNA是一种普遍存在于体内的重要调控基因,影响蛋白编码基因的表达,其和恶性肿瘤的发生发展有着紧密的联系,研究发现microRNA-338-3p是一种重要的抑癌基因。而神经纤毛蛋白1(neuropilin-1,NRP1)是一种多功能的跨膜糖蛋白,作为多种生长因子或其他配体的共受体,其在促进肿瘤的血管生成及侵袭转移等方面发挥着至关重要的作用。目前在肺癌研究中尚未报道两者之间的靶向关系,因此本文研究目的主要是研究 microRNA-338-3p 靶向调控下游靶基因 NRP1,探讨microRNA-338-3p-NRP1信号轴在肺癌发生发展中的作用及相关分子机制。[方法](1)通过荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测microRNA-338-3p在55例非小细胞肺癌组织和55例癌旁组织及3种肺癌细胞株(A549,H226及HCC827)和正常肺上皮细胞株BEAS-2B中的表达水平。(2)构建microRNA-338-3p的过表达质粒并将其转染至肺癌细胞株A549及H226中,并通过CCK-8、平板克隆实验、流式细胞仪检测、transwell侵袭迁移实验及划痕迁移实验检测A549及H226生长、增殖及侵袭转移能力。(3)通过生物预测软件,预测microRNA-338-3p的靶基因可能是NRP1。运用双荧光素酶活性检测实验验证microRNA-338-3p是否与NRP1 3’UTR区域的种子序列直接结合,以明确microRNA-338-3p对NRP1的靶向调控作用。(4)通过荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测靶基因NRP1在55例非小细胞肺癌组织和55例癌旁组织及3种肺癌细胞株(A549,H226及HCC827)和正常肺上皮细胞株BEAS-2B中的表达水平。并与对应组织中microRNA-338-3p的表达作回归分析,分析NSCLC中microRNA-338-3p和NRP1表达的相关性。(5)构建sh-NRP1慢病毒转染A549和H226细胞,检测转染前后NRP1 mRNA和蛋白表达变化。通过CCK-8、流式细胞仪检测细胞周期及平板克隆实验观察细胞的生长、增殖情况,并通过transwell细胞侵袭迁移实验和划痕实验观察细胞的侵袭与迁移能力。(6)利用A549细胞成功构建裸鼠皮下成瘤后,将过表达microRNA-338-3p agomir注入瘤体内,观察裸鼠肺癌皮下移植瘤的生长情况,并检测瘤体组织内microRNA-338-3p水平与NRP1的mRNA表达水平。(7)应用 Western blot 法检测过表达 microRNA-338-3p 后,A549 和 H226 细胞中EGFR,FAK及Akt磷酸化表达水平的变化,并检测EMT相关蛋白表达。(8)通过免疫印迹法检测过表达NRP1或敲弱NRP1后,在A549及H226细胞中相关信号通路及EMT相关蛋白的表达情况。(9)利用尾静脉注射sh-NRP1慢病毒感染A549细胞和空白载体sh-NC感染A549细胞,建立肺转移瘤模型,观察NRP1对体内肺癌的转移能力影响。(10)利用sh-NRP1敲弱细胞株,并分别联合EGFR-TKI或FAK抑制剂观察肺癌细胞增殖能力变化情况。[结果](1)qRT-PCR结果表明,microRNA-338-3p在55例肺癌组织中的表达也较55例癌旁组织明显降低(p<0.05),microRNA-338-3p在3种肺癌细胞株中的表达较正常肺上皮细胞明显降低(p<0.05)。(2)CCK-8、平板克隆实验、流式细胞仪检测、transwell小室侵袭实验及划痕实验结果表明,过表达microRNA-338-3p组中肺癌细胞株A549及H226的生长、增殖及侵袭转移能力较对照组明显降低(p<0.05)。(3)通过双荧光素酶检验结果显示microRNA-338-3p能明显抑制野生型NRP1 Psicheck TM-2载体的荧光强度(p<0.05),而无法抑制突变后NRP1 Psicheck TM-2载体的荧光强度(p>0.05),说明NRP1为microRNA-338-3p的下游靶基因。(4)在55例NSCLC组织样本中NRP1的表达上调。而在NSCLC中microRNA-338-3p 是低表达的。与 BEAS-2B 相比,在 NSCLC 细胞株 A549、H226和HCC827中NRP1的表达上调。(5)sh-NRP1慢病毒转染A549和H226细胞,检测转染后NRP1 mRNA和蛋白表达较对照组下调。通过CCK-8、平板克隆实验、流式细胞仪检测、transwell小室侵袭实验及划痕实验结果表明,敲弱NRP1后肺癌细胞株A549及H226的生长、增殖及侵袭转移能力较对照组明显降低(p<0.05)。(6)体内实验过表达microRNA-338-3p组中裸鼠肺癌移植瘤体积较对照组明显变小(p<0.05);过表达microRNA-338-3p后的瘤体组织中microRNA-338-3p水平较对照组明显上调,而NRP1的RNA水平较对照组明显减少,说明microRNA-338-3p是通过抑制NRP1的表达来抑制裸鼠移植瘤生长的。(7)Western blot检测结果表明,过表达microRNA-338-3p组中磷酸化EGFR,FAK及Akt的表达较对照组明显减少(p<0.05),回复实验证明,过表达NRP1能部分恢复过表达microRNA-338-3p组中磷酸化EGFR,FAK及Akt的表达水平,说明miR-338-3p是可以通过抑制NRP1的表达来调节相关信号通路的。(8)免疫印迹法检测结果表明,NRP1干扰组MMP2、MMP9、Smad3磷酸化水平、Vimentin、N-cadherin和Snail蛋白较对照组明显减少(p<0.05),反之,过表达NRP1 则促进 MMP2、MMP9、Smad3 磷酸化水平、Vimentin、N-cadherin 和 Snail表达上调,说明NRP1能调节肺癌的转移及上皮-间充质转化进程;过表达microRNA-338-3p 组中,Smad3 磷酸化水平、Vimentin、N-cadherin 和 Snail 蛋白较对照组明显减少(p<0.05),说明microRNA-338-3p和sh-NRP1一样,可以抑制肺癌的转移及上皮-间充质转化进程。(9)干扰NRP1后体内肺转移瘤实验结果发现肺部转移结节较对照组明显减少,具有统计学差异(p<0.05)。(10)干扰NRP1后可以提高肺癌细胞对EGFR-TKI或FAK抑制剂的敏感性。[小结]microRNA-338-3p作为一种抑癌基因,在肺癌中低表达。NRP1是癌基因,在肺癌中高表达,干扰NRP1后可以抑制肺癌的转移与迁徙,过表达可以促进增殖与转移,而过表达的microRNA-338-3p可以通过抑制NRP1的表达,经EGFR,FAK及Akt通路,来抑制肺癌的生长、增殖、侵袭转移及肺癌的上皮间充质转化。干扰NRP1后可以提高肺癌细胞对EGFR-TKI或FAK抑制剂的敏感性。