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研究背景骨密度的保持和骨骼结构的发育依赖于机械力学刺激。研究表明,机械力学刺激在骨重塑过程中促进骨形成,然而在长期制动或是失重环境下的去负荷状态导致骨质丢失。失重环境暴露可引起航天员各系统功能失调,其中最为严重的是非自限性骨质丢失,这将会增加航天员发生骨折的危险。长时间的失重暴露使骨质生成减少,骨质吸收增加。失重诱导的骨质丢失能够以骨密度每个月接近2%的速度下降,此种去负荷环境作用下一个月的骨质丢失量和绝经期妇女一年的骨质丢失量相当。研究已证实,成骨细胞增殖能力的减弱在失重性骨质丢失的过程中扮演重要角色,但具体机制尚不清楚。研究表明,钙离子是成骨细胞的重要调节因子,而钙离子通道,特别是L型电压依赖型钙离子通道(L-type calcium channels,LTCCs)在机械刺激诱导的成骨细胞增殖中发挥重要作用。一些证据表明,当LTCCs被激活时,骨密度增加伴随骨溶解减少。应用特异性LTCCs阻断剂,维拉帕米或nifedipine作用于成骨细胞可阻断机械刺激诱导的成骨细胞增殖。另有研究表明,机械刺激能够促进成骨细胞细胞外基质分泌增加,而应用特异性LTCCs阻断剂后此效应消失。所以LTCCs在成骨细胞增殖中发挥重要作用,且对力学信号敏感。LTCCs的调控因素很多,近年来mi RNAs成为LTCCs调控的研究热点。mi RNAs通过碱基互补原则与m RNA的特异性结合沉默m RNA,是重要的基因转录后调控机制。目前,已知有多条mi RNAs能够调控LTCCs,但在成骨细胞上鲜有研究报道。目的验证回转器模拟失重对成骨细胞增殖能力的影响;观察模拟失重环境下成骨细胞LTCCs的功能变化情况并探究相关机制;探索mi R-103/Cav1.2信号通路在模拟失重环境下对成骨细胞增殖的调控作用。方法1.采用Ed U染色、PCNA蛋白含量检测和CCK-8方法检测模拟失重环境下成骨细胞增殖的变化情况;2.利用Calcium imaging和膜片钳的方法检测模拟失重对成骨细胞LTCCs功能的影响;通过Western blotting技术检测模拟失重环境下成骨细胞Cav1.2蛋白表达情况;构建Cav1.2的小干扰RNA片段,并进行效率检测;将沉默效率较高的Cav1.2si RNA利用脂质体法转染进成骨细胞后,采用膜片钳技术检测LTCCs功能变化;利用LTCCs特异性阻断剂nifedipine和Cav1.2 si RNA阻断LTCCs功能,而后通过CCK-8方法检测成骨细胞在模拟失重环境下增殖情况的变化;3.通过Northern blotting技术和实时荧光定量PCR(q PCR)检测模拟失重对成骨细胞Cav1.2 m RNA表达的影响;利用q PCR筛选出在模拟失重环境下差异表达的能够靶向调控Cav1.2的mi RNA;构建mi R-103的mimic和inhibitor,并用q PCR确认其作用效果;将mi R-103 inhibitor利用脂质体法转染进成骨细胞后,通过Western blotting技术检测模拟失重环境下成骨细胞Cav1.2蛋白表达,并且利用膜片钳技术检测LTCCs功能变化;将mi R-103的mimic和inhibitor分别转染进细胞,而后通过CCK-8方法检测成骨细胞在模拟失重环境下增殖情况;利用脂质体法将mi R-103的mimic或inhibitor分别和Cav1.2 si RNA共转染进细胞,而后利用CCK-8方法检测成骨细胞在模拟失重环境下增殖情况。结果1.模拟失重降低成骨细胞Ed U染色阳性率;模拟失重降低成骨细胞PCNA的表达;模拟失重抑制成骨细胞的活性。2.模拟失重抑制Bay k8644诱导的成骨细胞内钙离子浓度增高;模拟失重抑制成骨细胞上LTCCs的电活动;模拟失重下调成骨细胞Cav1.2蛋白的表达;Cav1.2的表达下调抑制成骨细胞LTCCs的电活动;阻断LTCCs或下调Cav1.2表达加剧模拟失重对成骨细胞增殖的抑制作用。3.模拟失重上调成骨细胞Cav1.2 m RNA的表达;模拟失重上调成骨细胞mi R-103的表达;降低mi R-103的表达能够部分恢复模拟失重诱导的Cav1.2表达下调;降低mi R-103的表达能够部分对抗模拟失重对LTCCs电活动的抑制作用;在模拟失重环境下mi R-103抑制成骨细胞的增殖;在模拟失重环境下mi R-103抑制成骨细胞的增殖是Cav1.2依赖的。结论1.模拟失重抑制成骨细胞的增殖。模拟失重降低成骨细胞Ed U染色阳性率、抑制成骨细胞PCNA蛋白的表达和细胞活性,从多个角度证实了模拟失重对成骨细胞增殖的抑制作用。此部分现象观察实验明确了模拟失重对成骨细胞增殖的抑制作用,为我们进一步开展机制探讨奠定了基础。2.模拟失重抑制成骨细胞上LTCCs的功能。模拟失重通过下调成骨细胞Cav1.2蛋白的表达抑制LTCCs的功能,从而负性调控成骨细胞的增殖。这为阐明失重对成骨细胞增殖的负性调控提供了一个新机制。3.模拟失重通过激活mi R-103/Cav1.2信号通路抑制成骨细胞的增殖。模拟失重通过上调mi R-103,下调成骨细胞Cav1.2的表达,从而抑制LTCCs的电活动。而在模拟失重环境下mi R-103对成骨细胞增殖的调控主要是通过Cav1.2实现的。至此,我们发现模拟失重通过激活mi R-103/Cav1.2信号通路抑制成骨细胞的增殖。此项研究为失重对成骨细胞增殖的负性调控阐明了一个新机制,也为进一步研究失重性骨质丢失的细胞学机制提供了一个新方向。