【摘 要】
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背景:胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤,其发病机制复杂,其中钙信号异常与胃癌的发生发展密切相关。钙离子作为细胞内的第二信使参与调节肿瘤细胞的多种重要生物学行为如肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等。因此肿瘤细胞内钙离子稳态对细胞的功能和存活尤为重要。而经典瞬时感受器电位通道（transient receptor potential channels,TRPC）是细胞膜上调节细胞内外钙通量变化的重要钙离
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背景:胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤,其发病机制复杂,其中钙信号异常与胃癌的发生发展密切相关。钙离子作为细胞内的第二信使参与调节肿瘤细胞的多种重要生物学行为如肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等。因此肿瘤细胞内钙离子稳态对细胞的功能和存活尤为重要。而经典瞬时感受器电位通道（transient receptor potential channels,TRPC）是细胞膜上调节细胞内外钙通量变化的重要钙离子水平通道。针对TRPC的靶向抑制剂有望成为新的抗肿瘤药物。SKF96365是TRPC广谱抑制剂,现有研究发现SKF96365能够抑制食管癌、乳腺癌、结肠癌等在内的多种肿瘤细胞增殖。目前SKF96365在胃癌中的抗肿瘤作用及其分子机制尚不清楚。目的:探讨TRPC的广谱抑制剂SKF96365与顺铂联合给药对人胃癌细胞的抑制作用及其分子机制。方法:通过组织免疫荧光和RT-PCR方法鉴定胃癌组织及不同胃癌细胞中TRPC基因亚型;采用CCK-8法检测SKF96365与顺铂联合给药对胃癌细胞的药物抑制率;光学显微镜观察给药后胃癌细胞形态学上的改变;细胞克隆形成实验、细胞划痕试验检测联合给药对人胃癌细胞增殖、迁移能力的影响;采用Hoechst染色和流式细胞术检测联合给药后的细胞凋亡率;JC-1染色实验检测联合给药后细胞线粒体膜电位损耗;Mito ROS线粒体活性氧荧光探针、Rhod-2/AM荧光探针分别检测联合给药后细胞内线粒体活性氧浓度与线粒体钙离子浓度变化;蛋白免疫印迹实验检测联合给药后细胞凋亡、自噬蛋白水平及PI3K/AKT/BAD信号通路相关蛋白水平变化。结果:RT-PCR结果显示人胃癌细胞系MGC-803和HGC-27细胞中TRPC m RNA存在表达;免疫荧光显示不同分期胃癌组织样本中TRPC6表达与胃癌进展呈正相关性;CCK-8实验结果显示TRPC广谱抑制剂SKF96365联合顺铂能够有效抑制人胃癌细胞的活性;光学显微镜下观察到联合给药后细胞轮廓不清晰,染色质固缩、细胞核碎裂等形态学改变;克隆形成实验、细胞划痕试验提示SKF96365联合顺铂能够明显抑制人胃癌细胞系体外的增殖与迁移;采用Hoechst染色和流式细胞术检测结果显示SKF96365联合顺铂体外给药后两种人胃癌细胞系凋亡率升高;JC-1染色结果显示联合给药可显著降低胃癌细胞的线粒体膜电位,导致线粒体功能障碍;Mito ROS线粒体活性氧荧光探针与Rhod-2/AM荧光探针检测结果显示SKF96365联合顺铂用药后胃癌细胞内线粒体活性氧浓度升高,线粒体钙超载;蛋白免疫印迹实验结果显示联合给药提高了胃癌细胞凋亡、自噬相关蛋白水平,且显著抑制了胃癌细胞中PI3K/AKT/BAD信号通路磷酸化水平,提示SKF96365联合顺铂对胃癌细胞的抑制作用与PI3K/AKT/BAD信号通路抑制相关。结论:SKF96365联合顺铂通过抑制PI3K/AKT/BAD通路的磷酸化水平诱导胃癌细胞启动线粒体凋亡途径和细胞自噬促进胃癌细胞死亡达到抗肿瘤效果。
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