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研究目的：
近年来，临床上出现16S rRNA甲基化酶介导的对氨基糖苷类抗生素高水平耐药性引起人们的高度关注。随着碳青霉烯类抗生素在临床的广泛使用，耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌（CRE）越来越常见，主要为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌。据相关文献报道，全球已经开始出现同时产16S rRNA甲基化酶和碳青霉烯酶的多耐药肺炎克雷伯菌临床分离株，给公众生命健康构成巨大威胁。本研究旨在调查携带16S rRNA甲基化酶基因的血流感染相关耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的分子流行病学特征，为临床治疗由CRKPs引起的血流感染提供实验依据。
研究方法：
1.菌株收集和菌种鉴定：收集从2015年到2018年国内11家教学医院患者血液分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia,CRKP）非重复株137株，所有菌株通过梅里埃全自动微生物分析仪VITEK2系统进行鉴定，将阴沟肠杆菌ATCC700323作为鉴定质控菌株。
2.碳青霉烯酶及基因检测：根据2019版CLSI标准，对137株CRKPs进行改良碳青霉烯酶灭活实验（mCIM），检测各肺炎克雷伯菌临床分离株是否产碳青霉烯酶。使用聚合酶链式反应（PCR）检测137株CRKPs中产碳青霉烯酶基因，包括blaNDM、blaKPC、blaSPM、blaIMP、blaVIM、blaSIM、blaOXA-48、blaGIM、blaSME和blaGES。
3.16S rRNA甲基化酶基因检测：采用PCR法检测所有CRKPs中的16S rRNA甲基化酶基因，包括armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、rmtF、rmtG、rmtH和nmpA。PCR扩增后将产物1％琼脂糖凝胶电泳，然后进行Sanger测序，测得DNA序列采用BLAST程序在GenBank中进行比对，确定基因型。
4.药敏试验：根据2019版CLSI标准，采用微量肉汤稀释法检测17种抗生素对CRKPs的最低抑菌浓度（MIC）：包括碳青霉烯类（亚胺培南、美罗培南）、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合物（哌拉西林-他唑巴坦、头孢他啶-阿维巴坦）、单环β-内酰胺类（氨曲南）、头孢菌素类（头孢西丁、头孢噻肟、头孢他啶和头孢吡肟）、氨基糖苷类（庆大霉素、阿米卡星）、氟喹诺酮类（环丙沙星）、叶酸代谢途径抑制剂（复方新诺明）、四环素类（四环素、米诺环素、替加环素）和多粘菌素B，将大肠埃希菌ATCC25922和ATCC27853作为药敏实验的质控菌株。
5.分子分型：对78株携带16S rRNA甲基化酶基因的CRKPs进行多位点序列分型（MLST）和脉冲场凝胶电泳（PFGE），以研究不同肺炎克雷伯菌临床分离株的遗传关系。
6.全基因组测序（WGS）：对137株CRKPs进行全基因组测序分析。采用基因组流行病学中心提供的Resfinder程序（https://cge.cbs.dtu.dk/services/）对所有菌株所携带的耐药基因进行评估，通过比对肺炎克雷伯菌数据库中的毒力因子序列（http://www.mgc.ac.cn/VFs/），鉴定出各种毒力相关基因。从组装的基因组中确定所有分离株的多基因座序列分型（MLST）。采用克雷伯菌WGS数据在线平台工具Kaptive-web（http://kaptive.holtlab.net/）分析所有肺炎克雷伯菌分离株的血清型（K分型和wzi等位基因分型）。
研究结果：
1.碳青霉烯酶及基因检测：137株CRKPs临床分离株mCIM实验均为阳性，表明所有肺炎克雷伯菌临床分离株均产碳青霉烯酶。PCR检测结果显示，137株CRKPs中每株至少携带一个碳青霉烯类耐药基因，共检测到五种不同的碳青霉烯酶基因，包括blaKPC-2（n=110）、blaNDM-5（n=18）、blaNDM-1（n=16）、blaIMP-4（n=1）和blaIMP-30（n=2）。其中6株同时携带blaNDM-1和blaKPC-2，3株同时携带blaNDM-5和blaKPC-2，1株共同携带blaIMP-4和blaKPC-2。
2.16S rRNA甲基化酶基因检测：在137株检测的CRKPs临床分离株中，共有78株携带16S rRNA甲基化酶基因，检出率为56.9％（78/137），其中73株（73/137，53.3％）携带rmtB，8株（8/137，5.8％）携带armA，3株（3/137，2.2％）同时携带armA和rmtB。
3.药敏敏感性试验：在检测的137株CRKPs临床分离株中，94株（68.6％）和78株（56.9％）分别对庆大霉素和阿米卡星耐药，78株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌均对庆大霉素具有耐药性。78株携带16S rRNA甲基化酶基因的CRKPs均对头孢西丁、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢他啶、氨曲南、亚胺培南、美洛培南和、庆大霉素具有耐药性，但对多粘菌素B、替加环素、头孢他啶/阿维巴坦敏感。
4.分子分型：78株携带16S rRNA甲基化酶基因的CRKPs中共鉴定出5种ST型，包括ST11、ST15、ST2237、ST45和ST395，其中ST11是最流行的ST型（92.3％，72/78）。PFGE结果显示含有七个不同的簇，包括：A簇5株（5/78,6.4%）、B簇（62/78，79.5%）、C簇3株（3/78,3.8%）、D簇2株（2/78，2.6%）、E簇1株（1/78,1.3%）、F簇4株（4/78，5.2%）和G簇1株（1/78,1.3%）。其中72株ST11型分离株包含四个不同的PFGE簇：A簇（5/72，6.9%）、B簇（62/72，86.1%）、C簇（3/72，4.2%）和D簇（2/72，2.8%）。
5.通过全基因组测序结果分析，78株携带16S rRNA甲基化酶基因的CRKPs包含6种不同的荚膜多糖血清型：KL64-wzi64（70.5％，55/78）、KL47-wzi209（20.5％，16/78）、KL19-wzi19（5.1％，4/78）、KL3-wzi59（1.3％，1/78）、KL24-wzi101（1.3％，1/78）和KL27-wzi27（1.3％，1/78）。在78株携带16S rRNA甲基转移酶基因的CRKPs中，共鉴定出13个毒力相关基因，其中检出率超过50%的毒力相关基因包括Aerobactin（40/78，51.3%）、ybtA（77/78，98.7%）、ybtS（77/78，98.7%）、mrkD（77/78，98.7%）、WabG（78/78，100%）。将拉丝实验阳性（拉丝大于5mm）以及基因rmpA（rmpA或rmpA2）和iutA同时存在的菌株定义为hvKp菌株，在78株CRKPs临床分离株中，有33株（42.3%）为hvKp菌株。
6.经鉴定，78株携带16S rRNA甲基化酶基的CRKPs临床分离株中，主要克隆型为ST11-PFGE-B-KL64-wzi64（49/78,62.8%）、其次为ST11-PFGE-B-KL47-wzi209（12/78,15.4%）、ST11-PFGE-A-KL64-wzi64（3/78，3.8%）和ST11-PFGE-C-KL64-wzi64（3/78，3.8%）。
研究结论：
在中国教学医院分离的血流感染相关CRKPs临床分离株中16S rRNA甲基化酶基因的检出率较高，导致多重耐药，主要为ST11-PFGE-B-KL64-wzi64型克隆株播散所导致。
近年来，临床上出现16S rRNA甲基化酶介导的对氨基糖苷类抗生素高水平耐药性引起人们的高度关注。随着碳青霉烯类抗生素在临床的广泛使用，耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌（CRE）越来越常见，主要为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌。据相关文献报道，全球已经开始出现同时产16S rRNA甲基化酶和碳青霉烯酶的多耐药肺炎克雷伯菌临床分离株，给公众生命健康构成巨大威胁。本研究旨在调查携带16S rRNA甲基化酶基因的血流感染相关耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的分子流行病学特征，为临床治疗由CRKPs引起的血流感染提供实验依据。
研究方法：
1.菌株收集和菌种鉴定：收集从2015年到2018年国内11家教学医院患者血液分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia,CRKP）非重复株137株，所有菌株通过梅里埃全自动微生物分析仪VITEK2系统进行鉴定，将阴沟肠杆菌ATCC700323作为鉴定质控菌株。
2.碳青霉烯酶及基因检测：根据2019版CLSI标准，对137株CRKPs进行改良碳青霉烯酶灭活实验（mCIM），检测各肺炎克雷伯菌临床分离株是否产碳青霉烯酶。使用聚合酶链式反应（PCR）检测137株CRKPs中产碳青霉烯酶基因，包括blaNDM、blaKPC、blaSPM、blaIMP、blaVIM、blaSIM、blaOXA-48、blaGIM、blaSME和blaGES。
3.16S rRNA甲基化酶基因检测：采用PCR法检测所有CRKPs中的16S rRNA甲基化酶基因，包括armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、rmtF、rmtG、rmtH和nmpA。PCR扩增后将产物1％琼脂糖凝胶电泳，然后进行Sanger测序，测得DNA序列采用BLAST程序在GenBank中进行比对，确定基因型。
4.药敏试验：根据2019版CLSI标准，采用微量肉汤稀释法检测17种抗生素对CRKPs的最低抑菌浓度（MIC）：包括碳青霉烯类（亚胺培南、美罗培南）、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合物（哌拉西林-他唑巴坦、头孢他啶-阿维巴坦）、单环β-内酰胺类（氨曲南）、头孢菌素类（头孢西丁、头孢噻肟、头孢他啶和头孢吡肟）、氨基糖苷类（庆大霉素、阿米卡星）、氟喹诺酮类（环丙沙星）、叶酸代谢途径抑制剂（复方新诺明）、四环素类（四环素、米诺环素、替加环素）和多粘菌素B，将大肠埃希菌ATCC25922和ATCC27853作为药敏实验的质控菌株。
5.分子分型：对78株携带16S rRNA甲基化酶基因的CRKPs进行多位点序列分型（MLST）和脉冲场凝胶电泳（PFGE），以研究不同肺炎克雷伯菌临床分离株的遗传关系。
6.全基因组测序（WGS）：对137株CRKPs进行全基因组测序分析。采用基因组流行病学中心提供的Resfinder程序（https://cge.cbs.dtu.dk/services/）对所有菌株所携带的耐药基因进行评估，通过比对肺炎克雷伯菌数据库中的毒力因子序列（http://www.mgc.ac.cn/VFs/），鉴定出各种毒力相关基因。从组装的基因组中确定所有分离株的多基因座序列分型（MLST）。采用克雷伯菌WGS数据在线平台工具Kaptive-web（http://kaptive.holtlab.net/）分析所有肺炎克雷伯菌分离株的血清型（K分型和wzi等位基因分型）。
研究结果：
1.碳青霉烯酶及基因检测：137株CRKPs临床分离株mCIM实验均为阳性，表明所有肺炎克雷伯菌临床分离株均产碳青霉烯酶。PCR检测结果显示，137株CRKPs中每株至少携带一个碳青霉烯类耐药基因，共检测到五种不同的碳青霉烯酶基因，包括blaKPC-2（n=110）、blaNDM-5（n=18）、blaNDM-1（n=16）、blaIMP-4（n=1）和blaIMP-30（n=2）。其中6株同时携带blaNDM-1和blaKPC-2，3株同时携带blaNDM-5和blaKPC-2，1株共同携带blaIMP-4和blaKPC-2。
2.16S rRNA甲基化酶基因检测：在137株检测的CRKPs临床分离株中，共有78株携带16S rRNA甲基化酶基因，检出率为56.9％（78/137），其中73株（73/137，53.3％）携带rmtB，8株（8/137，5.8％）携带armA，3株（3/137，2.2％）同时携带armA和rmtB。
3.药敏敏感性试验：在检测的137株CRKPs临床分离株中，94株（68.6％）和78株（56.9％）分别对庆大霉素和阿米卡星耐药，78株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌均对庆大霉素具有耐药性。78株携带16S rRNA甲基化酶基因的CRKPs均对头孢西丁、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢他啶、氨曲南、亚胺培南、美洛培南和、庆大霉素具有耐药性，但对多粘菌素B、替加环素、头孢他啶/阿维巴坦敏感。
4.分子分型：78株携带16S rRNA甲基化酶基因的CRKPs中共鉴定出5种ST型，包括ST11、ST15、ST2237、ST45和ST395，其中ST11是最流行的ST型（92.3％，72/78）。PFGE结果显示含有七个不同的簇，包括：A簇5株（5/78,6.4%）、B簇（62/78，79.5%）、C簇3株（3/78,3.8%）、D簇2株（2/78，2.6%）、E簇1株（1/78,1.3%）、F簇4株（4/78，5.2%）和G簇1株（1/78,1.3%）。其中72株ST11型分离株包含四个不同的PFGE簇：A簇（5/72，6.9%）、B簇（62/72，86.1%）、C簇（3/72，4.2%）和D簇（2/72，2.8%）。
5.通过全基因组测序结果分析，78株携带16S rRNA甲基化酶基因的CRKPs包含6种不同的荚膜多糖血清型：KL64-wzi64（70.5％，55/78）、KL47-wzi209（20.5％，16/78）、KL19-wzi19（5.1％，4/78）、KL3-wzi59（1.3％，1/78）、KL24-wzi101（1.3％，1/78）和KL27-wzi27（1.3％，1/78）。在78株携带16S rRNA甲基转移酶基因的CRKPs中，共鉴定出13个毒力相关基因，其中检出率超过50%的毒力相关基因包括Aerobactin（40/78，51.3%）、ybtA（77/78，98.7%）、ybtS（77/78，98.7%）、mrkD（77/78，98.7%）、WabG（78/78，100%）。将拉丝实验阳性（拉丝大于5mm）以及基因rmpA（rmpA或rmpA2）和iutA同时存在的菌株定义为hvKp菌株，在78株CRKPs临床分离株中，有33株（42.3%）为hvKp菌株。
6.经鉴定，78株携带16S rRNA甲基化酶基的CRKPs临床分离株中，主要克隆型为ST11-PFGE-B-KL64-wzi64（49/78,62.8%）、其次为ST11-PFGE-B-KL47-wzi209（12/78,15.4%）、ST11-PFGE-A-KL64-wzi64（3/78，3.8%）和ST11-PFGE-C-KL64-wzi64（3/78，3.8%）。
研究结论：
在中国教学医院分离的血流感染相关CRKPs临床分离株中16S rRNA甲基化酶基因的检出率较高，导致多重耐药，主要为ST11-PFGE-B-KL64-wzi64型克隆株播散所导致。