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七鳃鳗是现有的最主要的脊椎动物代表,从遗传信息的角度来看,其基因组较为原始,对于研究脊椎动物的起源与进化有着至关重要的作用,故被公认为现有无颚脊椎动物最理想的模式生物。细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶-2(cyclin-dependent protein kinase-2,CDK-2)CDK-2是一种Ser/Thr蛋白激酶,是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinase,CDK)家族中的一员,在动物体各个组织中均有表达,具有多种生物学功能,在细胞周期调控、DNA复制、DNA损伤、细胞凋亡及衰老中发挥重要作用,与多种疾病的发生紧密相关。CDK-2在其他颌骨脊椎动物中得到了广泛研究,但在无颌脊椎动物中可能存在的潜在作用却知之甚少。该论文首次克隆得到七鳃鳗CDK-2-like的全长序列,并对蛋白功能进行了初探,取得如下研究成果:首先,本论文在七鳃鳗白细胞的c DNA文库中成功克隆出长度为897bp,编码298个氨基酸残基的CDK-2-like全长基因。对CDK-2-like进行同源序列比对分析发现,CDK-2-like与其他有颌类脊椎动物CDK-2具有约80%的同源性。构建不同物种的CDK-2系统发育树,表明七鳃鳗CDK-2-like处于有脊椎动物和无脊椎动物的中间,符合从低级动物到高级动物渐序进化的客观规律。其次,该论文成功地构建了CDK-2-like的原核表达质粒。经原核表达及蛋白纯化后获得了可溶性的CDK-2-like重组蛋白纯品。以重组蛋白纯品作为抗原,免疫新西兰大白兔,制得高度特异性的兔抗CDK-2-like多克隆抗体。蛋白质免疫印迹法和流式细胞术检测后结果均表明,抗体特异性良好且亲合能力强。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和蛋白质免疫印迹结果显示,CDK-2-like在七鳃鳗的性腺组织中表达水平较高。通过免疫荧光和激光共聚焦实验,发现CDK-2-like主要定位于七鳃鳗白细胞的细胞质与细胞核内。再次,该论文对CDK-2-like在细胞凋亡中的作用进行了初探,发现Act-D诱导的凋亡可降低CDK-2-like转录水平及蛋白表达水平。过表达CDK-2-like可抑制Act-D诱导的HEK-293T细胞凋亡。在正常七鳃鳗白细胞中加入CDK-2抑制剂PHA-848125可诱发凋亡,且可略降低CDK-2-like的表达。此外,我们还发现Act-D和CDK-2抑制剂PHA-848125在诱导细胞凋亡方面有协同作用,且PHA-848125可以辅助Act-D在一定程度上降低CDK-2-like的表达,可见CDK-2-like与细胞凋亡有着密切的关系。以上研究皆为客观地评价CDK-2-like在脊椎动物中的进化以及探明其在细胞凋亡中的作用提供实验基础。