随着石油资源的大量消耗和环境污染的日益加剧,利用可再生资源生产平台化合物的生物炼制技术吸引了越来越多的关注。戊二酸是一种具有重要用途的C5平台化合物,可用于化学工业中聚酯和聚酰胺（如尼龙-4,5和尼龙-5,5）的合成。戊二酸主要通过石油化学前体经不同化学加工而获得,但是该方法具有污染环境严重,成本高和工艺流程复杂等缺点。因此,以生物质为基础的戊二酸生产方法逐渐吸引了全世界的关注。戊二酸的低得率一直是限制其生物技术生产的瓶颈,因而对戊二酸代谢途径和调控机制进行深入研究,彻底阻断戊二酸的下游代谢途径,将为工业上通过生物技术路线提高戊二酸产量提供理论基础和实验依据。戊二酸是动物、植物和微生物中的重要代谢物,广泛分布于不同生境,并能在多种氨基酸（如L-赖氨酸、L-羟基赖氨酸、L-色氨酸）和芳香族化合物（如尼古丁酸、苯甲酸）的生物代谢过程中产生。在以往研究中,唯—报道的戊二酸分解代谢途径是戊二酰辅酶A脱氢途径。在这条途径中,戊二酸首先被转变为戊二酰辅酶A,随后戊二酰辅酶A脱氢酶（GcdH）催化戊二酰辅酶A的α,β-脱氢（将戊二酰辅酶A转变成戊烯二酰辅酶A）和脱羧（将戊烯二酰辅酶A转变为巴豆酰辅酶A和CO2）生成巴豆酰辅酶A。巴豆酰辅酶A经脂肪酸代谢途径转化为乙酰乙酰辅酶A,随后转化为2分子的乙酰辅酶A进入TCA循环。工业菌株E.coli虽然不含戊二酰辅酶A脱氢途径,理论上不存在戊二酸的进一步代谢,但是其转化L-赖氨酸生产戊二酸的得率却相当低,这种现象促进我们去研究生物体内是否存在其他未知的戊二酸代谢途径。本论文考察了恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）KT2440利用戊二酸生长的能力,发现在戊二酰辅酶A脱氢途径阻断的情况下,该菌株仍然能够利用戊二酸进行生长,推测P.putida KT2440中存在一条之前未被鉴定的戊二酸代谢途径。通过比较基因组学和基因表达分析,推测P.putida KT2440中存在一条戊二酸羟基化代谢途径,CsiD和LhgO为该途径的两个关键酶。本论文对P.putida KT2440中戊二酸羟基化途径的关键酶展开研究,对CsiD和LhgO进行了外源表达和酶学性质鉴定。酶学研究发现CsiD是Fe2+/2-酮基戊二酸（2-KG）依赖性的戊二酸羟化酶,对2-KG具有非特异性的酶活,能够催化2-KG产生琥珀酸。CsiD还具有戊二酸羟化酶的功能,能够特异性地作用于戊二酸,并将戊二酸羟基化为L-2-羟基戊二酸（L-2-HG）。CsiD是一个同源八聚体,其对戊二酸的酶活依赖于2-KG和Fe2+的存在。而LhgO是一个FAD依赖型的L-2-HG氧化酶,能够催化L-2-HG转变为2-KG。LhgO具有非常高的底物特异性,仅对L-2-HG具有较高的催化活性。除了揭示一条新的戊二酸代谢途径以外,本论文还揭示出了一种新的L-2-HG产生途径。在最近的研究中,人们普遍认为L-2-HG的来源是乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶在酸性和缺氧条件下“混杂”的催化活性。然而,在本论文中,我们证实L-2-HG也能够来源于戊二酸的羟基化,并且可以作为戊二酸代谢的一种中间产物。L-2-HG是多种2-KG依赖性双加氧酶的抑制剂,这些2-KG依赖性的双加氧酶参与多种生物进程,如脯氨酰羟化和组蛋白去甲基化等。如同它的镜像异构体D-2-羟基戊二酸（D-2-HG）一样,L-2-HG之前也被认为是一种能导致病变的非正常代谢物。但随着研究的深入,人们逐渐发现L-2-HG具有多重生理功能,如减轻细胞还原压力和帮助细胞适应缺氧环境。本论文发现L-2-HG也是多种有机物（如L-赖氨酸、L-色氨酸、苯甲酸等）代谢过程中一种重要的代谢中间物。L-2-HG的产生和生理功能比目前已知的情况要复杂得多。除了目前已经报道的能够产生L-2-HG的酶以外,其他与L-2-HG代谢相关的酶和组分还值得进一步研究。本论文进一步对戊二酸羟基化途径在P.putida KT2440戊二酸分解代谢中的功能展开研究,发现P.putida KT2440中的戊二酰辅酶A脱氢途径和戊二酸羟基化途径共同参与戊二酸代谢。通过生长曲线测定,平板生长验证,竞争力实验分析和生长模型建立等方法,证明戊二酸羟基化途径比戊二酰辅酶A脱氢途径在代谢戊二酸时具有竞争优势。该竞争优势并不是由于这两条途径被诱导的先后顺序不同,而是途径本身的生化特性所导致的,即戊二酸羟基化途径提供了能更快被菌体利用的代谢物琥珀酸,而使其具有竞争优势。通过对戊二酸代谢途径的深入分析,我们提出了P.putida KT2440中戊二酸代谢的模型。在该模型中,戊二酰辅酶A被GcdH转变为巴豆酰辅酶A,随后转变为两分子乙酰辅酶A以提供TCA循环的C2化合物。戊二酸也能被CsiD和LhgO转变为琥珀酸,为TCA循环提供C4化合物。乙醛酸循环能将乙酰辅酶A缩合为C4化合物,也参与到戊二酸代谢过程中。这三个途径（即戊二酸羟基化途径、戊二酰辅酶A途径和乙醛酸循环）共同实现了戊二酸的有效利用,考虑到戊二酸经戊二酰辅酶A途径可产生生酮化合物乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A,经羟基化途径可产生生糖化合物琥珀酸,L-赖氨酸并非生酮氨基酸,而应该重定义为生酮生糖氨基酸。通过L-赖氨酸的分解代谢可以实现戊二酸的生物技术法生产,我们尝试在P.putiad KT2440中彻底阻断戊二酸代谢途径以实现戊二酸的高效生产。通过使用不含有戊二酸羟基化途径和戊二酰辅酶A脱氢途径的P.putida KT2440（ΔgcdHΔcsiDΔalr）,戊二酸的浓度提高到了 1.94 gL-1。更重要的是,从L-赖氨酸生产戊二酸的摩尔转化率提高到了 0.85 mol mol-1。尽管在E.coli中不存在GcdH,但是存在戊二酸羟基化途径的两个关键酶（CsiD和LhgO）,这可能是使用重组E.coli生产戊二酸时产量低的原因。在E.coli中敲除csiD和lhg0可能是通过生物技术路线提高戊二酸产量的一个有用策略。P.putida KT2440中戊二酸的代谢受到CsiR和GcdR的严格调控。本论文从戊二酸代谢途径相关基因簇的转录结构,转录起始位点,启动子活性,调控蛋白的结合位点和效应物等方面,分别探究CsiR对戊二酸羟基化途径和GcdR对戊二酰辅酶A脱氢途径的调控机制。对戊二酸羟基化途径来说,csiD和lhgO组成了一个操纵子,csiR与csiD转录方向相反;在csiD操纵子上游鉴定出两个转录起始位点,其中转录起始位点TSS1上游包含与戊二酸代谢有关的启动子;调控蛋白CsiR在活性状态下以二聚体的形式存在,能够与csiD启动子区域结合,结合区域覆盖住了-10区和-35区,对csiD基因的转录具有阻遏调控作用,其效应物为戊二酸和L-2-HG。本论文首次报道一种参与L-2-HG代谢,且能够以L-2-HG作为效应物的调控蛋白CsiR。对戊二酰辅酶A脱氢途径来说,gcdH和pp0159组成了一个操纵子,gcdR与gcdH转录方向相反;在gcdH转录起始位点上游包含与戊二酸代谢有关的启动子;调控蛋白GcdR能够与gcdH启动子区域结合,对gcdH基因的转录具有激活调控作用,其效应物为戊二酸和戊烯二酸。通过启动子活性分析,生长曲线测定和凝胶阻滞实验等手段分析两条途径在调控方面的相互作用,发现戊二酸羟基化途径和戊二酰辅酶A脱氢途径在调控方面是相互独立的,CsiR和GcdR不存在交叉调控。综上,本论文提出了一条新的戊二酸羟基化代谢途径,基于对其关键酶的基本酶学性质和生理功能分析,揭示出一个新的L-2-HG来源,并确定了戊二酸羟基化途径在P.putida KT2440戊二酸代谢中的作用;进而阐明了戊二酸代谢途径的调控机制,完善了对生物体内戊二酸代谢途径和调控机制的认识,为探索其他的L-2-HG来源提供有益借鉴,并为工业上利用生物技术方法生产戊二酸奠定了理论基础,对推进戊二酸生物法生产的工业化应用具有积极的现实意义。