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牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是我国的传统名花,是繁荣昌盛、和平幸福的象征。自古以来有“花中之王”、“国色天香”、“富贵花”的美誉。春节催花是牡丹产业的主要内容之一,传统催花不良甚至催花失败的现象常有发生。理解休眠解除调控机理是完善催花技术、解决生产中存在问题的理论基础。黄鑫等通过差异文库筛选得到PsSERK1基因的部分cDNA片段,并推测在低温解除牡丹休眠过程中可能参与花芽分生组织分裂活动和花器官形成有关。阐明PsSERK1基因在低温解除休眠中的生物学功能,对深入理解低温解除休眠的分子机制具有重要的意义。本实验选用山东菏泽牡丹基地4年生牡丹品种‘鲁荷红’(PaeoniasuffruticosaAndr.‘Luhehong’)的健壮植株,以4℃冷库处理作为低温环境,分为五个低温处理,低温0d作为对照。本研究采用苏木精石蜡组织切片技术观察组织细胞变化,拟克隆PsSERK1基因后得到该基因全长序列,利用生物信息学软件分析预测其功能,采用Northen杂交、定量PCR分析PsSERK1基因表达规律,结合组织学的研究探讨其可能功能,进而为探讨PsSERK1基因在牡丹花芽休眠解除中分子机理研究奠定基础。实验结果如下:
1.未感受低温的牡丹花芽,不能萌动、开花;低温处理5d的牡丹花芽,萌动率较低,仍然不能开花;低温处理10d的牡丹花芽,花芽萌动率,成花率较低;低温15d的牡丹花芽,成花率,萌动率较高,此时休眠基本解除;低温23d的牡丹花芽萌动率,成花率最高,休眠完全解除。
2.通过对牡丹休眠解除解除过程花芽进行切片处理,各个原基细胞不断进行平周、垂周分裂从而使花瓣原基向内伸长、增粗;雄蕊原基在低温10d后开始柱状伸长生长;雌蕊原基在低温处理10d的时候已经分化完成,低温处理23d的时候,向上突起呈圆丘状。各原基细胞分裂频率随着低温处理时间的累加,存在差异显著变化,低温处理时间越长,细胞分裂频率越高,休眠解除的越快。
3.按照RACE试剂盒设计引物的要求和已知中间片段序列,设计了两个特异性引物,分别从5和3端采用RACE-PCR技术扩增到目的片段,将片段连接pMD18-T载体上,转化大肠杆菌,经HindⅢ/BamHⅠ双酶切鉴定,证明克隆片段已经插入pMD18-T载体。测定了两个克隆片段序列,然后根据已知目的片段序列,通过拼接得到PsSERK1基因全长序列。PsSERK1基因全长序列2864bp。其中,5非编码区(UTR)为714bp,3UTR为313bp和28个碱基的poly(A)尾,并且含有一个完整的ORF为1794bp,编码598个氨基酸。同源性分析得出,与PsPSERK1同源性最高的物种是葡萄(Htisvinifera),同源性达95%。
4.采用Northen杂交、荧光定量PCR相结合技术,PsSERK1基因在休眠解除过程中表达规律,在五个低温处理的不同时期,PsSERK1基因在RNA水平上的变化趋势是低温初期表达量增加,低温10d其表达量达到最大值,而后其相对表达量降低。推测PsSERK1基因上调表达促进了内休眠花芽的后发育。