论文部分内容阅读
蒙药肋柱花为龙胆科植物肋柱花Lomatogonium rotatum(L.)Fries ex Nym的干燥全草。对胆痞、黄疸、消化不良、巴达干协日合并症、协日热等病症具有主治作用。蒙药肋柱花化学成分较复杂，目前，从肋柱花中分离得到了许多化学成分，包括黄酮类、三萜类、环烯醚萜类、内酯类、有机酸及其酚类化合物。其中，分离得到的黄酮类化合物较多，其次是三萜类化合物。研究发现黄酮类化合物和三萜类化合物在抗肿瘤、抗氧化、抗炎、调节免疫等方面具有显著的功效。 本课题采用HPLC法对蒙药肋柱花中几种化学成分进行含量测定，在同一色谱条件下测出多种化学成分含量，为蒙药肋柱花质量控制提供依据；在单因素试验的基础上，采用超声提取方法，研究乙醇浓度、液料比、超声时间对肋柱花总黄酮和总皂苷提取量的影响，并采用响应面法优化蒙药肋柱花总黄酮和总皂苷超声提取工艺条件。通过RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术克隆黄酮类和三萜类化合物代谢途径的关键酶基因，查尔酮合成酶（LrCHS）和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（LrHMGR），并对其进行生物信息学分析。对肋柱花黄酮和三萜类成分含量的影响及其调控机制提供基础资料。主要研究结果如下： 1.采用HPLC法同时测定蒙药肋柱花中当药黄素、木犀草苷和木犀草素3种成分的含量，采用YMC C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，流动相为乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0~10min，15%A；10~20min，15%→17%A；20~25min，17%→20%A；25~30min，20%→29%A；30~40min，29%→40%A）；柱温30℃；流速1.0mL?min-1；检测波长350nm。结果：当药黄素、木犀草苷和木犀草素分别在0.10~0.71μg（r=0.99999）、0.05~0.37μg（r=0.99998）、0.05~0.38μg（r=0.99999）范围内呈良好线性关系。 2.采用HPLC法测定蒙药肋柱花中齐墩果酸含量，采用YMC C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，流动相为乙腈-水（64:36），柱温25℃；流速0.8mL?min-1；检测波长210nm。结果：齐墩果酸在1.32~7.94μg（r=0.9996）范围内呈良好线性关系。 3.在单因素试验的基础上，采用超声提取方法，研究乙醇浓度、液料比、超声时间对肋柱花总黄酮提取量的影响，并采用响应面法优化蒙药肋柱花总黄酮超声提取工艺条件，通过回归方程分析及验证试验确定最佳提取工艺条件为：乙醇浓度65%，液料比20mL/g，超声时间20min。在此条件下，总黄酮含量为21.26mg/g，与理论预测值21.15mg/g非常接近。二项式拟合复相关系数R2=0.9568。 4.在单因素试验的基础上，采用超声提取方法，研究乙醇浓度、液料比、超声时间对肋柱花总皂苷提取量的影响，并采用响应面法优化蒙药肋柱花总皂苷超声提取工艺条件，通过回归方程分析及验证试验确定最佳提取工艺条件为：乙醇浓度77%，液料比40mL/g，超声时间33min，在此条件下总皂苷含量为27.36mg/g，实验结果接近理论预测值。二项式拟合复相关系数R2=0.9175。 5.研究蒙药肋柱花查尔酮合成酶基因（LrCHS）的克隆，利用RT-PCR及RACE技术获得了1608bp的LrCHS cDNA序列，其包含一个1170bp的ORF，起始密码子ATG，终止密码子TGA，编码389个氨基酸，5'非编码区为131bp，3'非编码区为307bp。其蛋白分子式为C4912H8218N1608O2073S305，分子量为132.7kDa，理论等电点为5.00，含有0个带正电荷的氨基酸残基，0个带负电荷的氨基酸残基，不稳定系数为39.55，属于稳定性蛋白。 6.研究蒙药肋柱花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（LrHMGR）的克隆，利用RT-PCR及RACE技术获得了1564bp的LrHMGR cDNA序列，其包含一个1161bp的ORF，起始密码子ATG，终止密码子TAG，编码386个氨基酸，5'非编码区为93bp，3'非编码区为310bp。其蛋白分子式为C1772H2884N480O542S28，分子量为40.48kDa，理论等电点为7.49，含有34个带正电荷的氨基酸残基，33个带负电荷的氨基酸残基，不稳定系数为33.06，属于稳定性蛋白。